小鼠腦動脈平滑肌鈣激活鉀通道基本特性和動力學調控研究＊

劉雪茹，譚曉秋，楊 艷，曾曉榮，唐顯玲△

（瀘州醫學院附屬醫院：1.麻醉科；2.醫學電生理省部共建教育部重點實驗室，四川瀘州 646000）

大電 導鈣激活鉀通道 （large conductance Ca2＋－activated K＋channels，BKCa）在血管平滑肌等多種組織中表達，并且在許多病理和生理過程中起重要作用，是一些內源性和外源性血管活性物質發揮作用的重要靶點［1］。BKCa在血管平滑肌細胞上分布極為豐富，攜帶約70%～80%的外向電流，BKCa的激活引起膜的超極化，從而調節細胞的興奮性［2］。近年來，細胞內局部自發性的Ca2＋釋放事件日益引起了人們的關注。平滑肌細胞內肌質網（sarcoplasmic reticulum，SR）上鈉諾定鈣釋放通道的協調開放產生的鈣火花引起細胞內局部、瞬時的Ca2＋濃度升高激活鄰近細胞膜上的BKCa，使其開放概率顯著增加，產生自發瞬時外向電流（spontaneous transient outward currents，STOCs）［3］。STOCs可進一步引起細胞膜超極化，抑制經L型鈣通道的Ca2＋內流，促使平滑肌舒張。本研究通過應用兩性霉素B穿孔的全細胞膜片鉗技術，在前期工作基礎上，研究急性酶分離的小鼠腦動脈平滑肌細胞STOCs的基本特性，并利用單通道膜片鉗技術進行通道動力學調控研究。

1 材料與方法

1.1 材料 正常小鼠10只，體質量18～22g，雌雄不拘，由瀘州醫學院動物房提供。F型膠原酶、Ⅱ型膠原酶、二硫蘇糖醇（DTT）、二巰基赤蘚醇（DTE）、木瓜蛋白酶、清蛋白、兩性霉素B、IbTX均購自Sigma公司，其余試劑為國產分析純。采用微管電極拉制儀（PC－10，Narishige，Japan）進行玻璃微管電極的拉制，電極在充灌電極液后尖端阻抗為2～4MΩ，電流信號經膜片鉗放大器（Axopatch 200B）放大，2kHz低通濾波，經12位A／D－D／A轉換器（Digidata1322A）轉換后在專用軟件系統pClamp（Version 9.0，Axon Instruments，USA）控制下記錄并儲存于計算機硬盤內，采樣頻率為10kHz，適當補償串阻后的入口阻抗小于或等于10MΩ。

1.2 單個腦動脈平滑肌細胞的分離 小鼠斷頭處理，迅速取出大腦置于冰的生理鹽溶液（PSS）中，小心分離出大腦底部動脈（包括willis環及其分支），置于4℃低鈣PSS液（0.1mmol／L CaCl2）中，去除血管周圍組織及筋膜，將血管組織置于盛有酶Ⅰ（0.3mg／mL木瓜蛋白酶和0.2mg／mL DTE）EP管中，36.5℃恒溫水浴箱中消化7.0～7.5min；再加入酶Ⅱ（0.8 mg／mL F型膠原酶，1.0mg／mLⅡ型膠原酶和1.0mg／mL DTT）消化7.0～7.5min，輕輕吹打，得到單個腦動脈平滑肌細胞，置于4℃冰箱備用。

1.3 全細胞電流的記錄 全細胞電流記錄采用兩性霉素B（200μg／mL）穿孔膜片鉗進行。浴液為：NaCl 137mmol／L，KCl 5.9mmol／L，MgCl21.2mmol／L，CaCl21.8mmol／L，glucose 14mmol／L，HEPES 10mmol／L，pH 7.4（NaOH）；電極液為：KCl 128mmol／L，NaCl 12mmol／L，MgCl24mmol／L，HEPES 10mmol／L，EGTA 0.05mmol／L，pH 7.2（KOH），200 μg／mL兩性霉素B。對于宏觀電流記錄采用階躍刺激方案（保持電位－60mV，從－60～＋60mV，時程400mV）和斜坡刺激方案（保持電位－60mV，從－80～＋70mV，斜率0.375V／s，時程400ms），刺激頻率1Hz，采樣頻率10kHz。STOCs記錄采用固定某一電位進行記錄，時程30s。

1.4 單通道電流的記錄 單通道電流記錄主要采用insideout構 型 進 行 。 電 極 內 液 成 分 ：K－Asp 40mmol／L，KCl 100 mmol／L，pH 7.2HEPES－K 10mmol／L，EGTA 2mmol／L；浴液成分：K－Asp 100mmol／L，KCl 40mmol／L，pH 7.4HEPESK 10mmol／L和EGTA 1mmol／L。分別記錄不同電壓和不同游離Ca2＋濃 度（0、10－8、10－7、10－6、10－5mol／L）下 B KCa的活性，選取膜電位＋40mV時的電流作為統計值，分析BKCa的電壓依賴性、Ca2＋敏感性和通道動力學特征。

1.5 統計學處理 采用 M iniAnalysis program（synaptosofl software，leonia，NJ）分析STOCs（鉗制電位＝－30mV，記錄30s）的幅度和頻率，設定STOCs的閾值為10pA，其余膜片鉗數據采用ClampFit 10.1進行分析。采用SPSS 14.0軟件單因素方差進行統計學分析，計量資料采用±s表示，以P＜0.05為差異有統計學意義。藥物濃度與標準化的總開放概率（NPo）關系用 H ill方程Y＝Xb／（cb＋Xb）（X：胞內游離 C a2＋濃度；c：Ca2＋解 離常數（Kd）；b：希氏常數（nH）。

2 結 果

2.1 BKCa全細胞基本特性 本實驗采用全細胞穿孔膜片鉗技術記錄BKCa宏觀電流和STOCs，保持電位為－60mV，接近平滑肌細胞的靜息電位。結果顯示，BKCa激活呈明顯電壓依賴性，隨著去極化電壓的增加，BKCa宏觀電流密度明顯地增加（圖1）。進一步分析宏觀電流特征可以看出，STOCs隨機疊加于BKCa宏觀電流之上，呈大噪聲樣（圖1）。而對于STOCs的記錄則在持續穩定的膜電位下進行長時程采樣分析（－50～0 mV，共6個電位水平，持續時間30s）。多個膜電位水平均可記錄到STOCs，隨著膜去極化電位的增加，STOCs的頻率和幅度均增加，表現出明顯的電壓依賴性。BKCa宏觀電流和STOCs都能被BKCa的特異性阻斷劑IbTX（200nmol／L）抑制（圖1），表明STOCs電流主要為BKCa所攜帶。

2.2 BKCa單通道基本特性 采用inside－out和outside－out膜片記錄BKCa的單通道特性（圖2）。在inside－out構型下，本實驗還采用了內面向外單通道膜片鉗技術對BKCa進行研究。在浴液和電極液呈對稱性高鉀（140mmol／L）狀態下，鉗制電位從－40mV去極化到＋40mV，每次記錄時間為30s，可見隨著鉗制電位的增加，通道開放頻率明顯增加。將不同電壓下的通道開放概率作圖并經過Boltzmann方程擬合，得到通道的電壓依賴性曲線和半數最大激活電壓（V1／2）為78.09mV。

通過改變細胞膜內外 K＋濃度，即［K＋］o∶［K＋］i＝140∶140，［K＋］o∶［K＋］i＝140∶6，［K＋］o∶［K＋］i＝6∶140，分別在以上幾種情況下記錄不同鉗制電位下的電流，然后做I－V曲線，經Goldman－Hodgkin－Katz方程擬合，得到反轉電位與倫斯特方程EK＝（RT／F）ln［K＋］O／［K＋］i計算得到的理論值基本一致，在對稱性高鉀溶液中，BKCa的反轉電位為零，結果表明BKCa具有明顯的K＋選擇性（圖2）。在對稱性高鉀溶液中，通過計算得到單個BKCa電導值為（205.4±43.6）pS（n＝25），表明BKCa具有大電導特性。

圖1 小鼠腦動脈平滑肌BKCa宏觀電流和STOCs基本特性

圖2 小鼠腦動脈平滑肌BKCa單通道電流基本特性

圖3 胞內Ca2＋對BKCa動力學的影響

另外，改變浴液Ca2＋濃度，可見通道具有明顯的Ca2＋依賴性，開放概率隨著浴液游離Ca2＋濃度的增加而增加，在Ca2＋濃度為0.5μmol時，通道呈多個水平同時開放，見圖2。將不同［Ca2＋］free時通道的標準化開放概率進行擬合，得到［Ca2＋］free的 量 效 曲 線 和 通 道 Ca2＋解 離 常 數 （Kd）為0.881μmol／L（圖2）。在外面向外式膜片下，BKCa的特異性阻斷劑IbTX（200nmol）能明顯抑制該電流（IbTX作用于通道外口）。

2.3 Ca2＋對BKCa的動力學調控 為研究Ca2＋對通道的動力學調控，選擇了［Ca2＋］free＝0.1μmol／L和0.5μmol／L進行分析。從圖3可以看出，［Ca2＋］free＝0.5μmol／L時，BKCa的開放時間常數明顯降低［（2.599 0±0.452 6）vs（1.596 0±0.357 3）ms，P＜0.05，n＝5］，但是通道的關閉時間常數沒有明顯改變［（1.041 0±0.231 4）vs（0.952 0±0.186 3）ms，P＞0.05，n＝5］（圖3）。進一步采用開放和關閉兩個狀態分析通道的動力學，［Ca2＋］free由0.1μmol／L 增加到0.5μmol／L時，通道的開放速率明顯增加（由384.72s－1增加到626.71 s－1）然而，通道的關閉速率沒有明顯影響，見圖3。表明胞內Ca2＋通過促進了BKCa由關閉向開放狀態的轉變而激活BKCa，但是沒有改變通道從開放狀態向關閉狀態的轉變。

3 討 論

鉀通道及他們攜帶的K＋電流在血管張力的調節中十分重要。血管平滑肌上的鉀通道主要有鈣激活鉀通道（KCa），ATP敏感鉀通道（KATP），延遲整流鉀通道和電壓依賴性鉀通道。其中主要為大電導鈣激活鉀通道，攜帶約70%～80%的外向電流，其功能狀態及變化對平滑肌的緊張性調節起重要作用［4］。本研究旨在研究小鼠腦動脈平滑肌細胞BKCa基本電生理特性，包括鈣敏感性、電壓依賴性、K＋選擇性、大電導特性、IbTX依賴性等，結果表明小鼠腦動脈平滑肌細胞BKCa具有與人腸系膜動脈平滑肌、人奧迪括約肌、支氣管平滑肌、豬冠狀動脈平滑肌、大鼠主動脈平滑肌等組織BKCa類似的電生理學特性［5－7］。平滑肌細胞全胞性胞內鈣濃度的增加激活肌質網上的納諾定受體，引起胞內鈣庫釋放鈣（Ca2＋－induced Ca2＋release，CICR），產生鈣火花，這種局部Ca2＋濃度升高激活鄰近的BKCa通道產生STOCs，引起細胞膜的超極化，導致細胞舒張。STOCs是胞內鈣火花事件在膜電流變化上的體現。因此，STOCs是反 應 BKCa通 道 胞 內 鈣 敏 感 性 的 指 標 之 一［3，8－9］。STOCs只在細胞功能活動正常時才能記錄到。通過STOCs電流的記錄可以看出，通道電流非常容易記錄，細胞具有較好的活性，利于研究通道功能調控和血管活性藥物的作用機制。

通道動力學調控機制是通道功能調控的重要組成部分。隨著研究的深入，探討藥物作用的門控動力學機制、分析藥物作用的離子通道靶點已成為目前藥物研究的熱點之一。研究表明，不同藥物對BKCa的門控動力學機制可能表現不一，不同的動力學特征表明藥物作用位點的不同。如中藥厚樸則對BKCa的開放和關閉狀態均起作用，一方面促進了通道由關閉向開放狀態的轉變，另一方面抑制了通道由開放向關閉狀態的轉變［10］。本研究得出Ca2＋對通道的門控動力學主要表現為促進了通道由關閉狀態向開放狀態的轉變，這與在其他標本的研究結果一致。表明小鼠腦動脈血管平滑肌BKCa可以作為通道門控動力學調控研究的理想標本之一。

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