突變型DNA聚合酶β真核表達載體的構建及其表達＊

趙四敏，陳旭東，趙國強，董子明

（漯河醫學高等專科學校：1.病理生理學教研室；2.微生物學與免疫學教研室，河南漯河 462002；鄭州大學基礎醫學院：1.微生物學與免疫學教研室；4.病理生理學教研室，鄭州 450001）

DNA 聚合酶β（DNA polymeraseβ，polβ）是真核細胞DNA聚合酶家族的一員，為一看家基因，基因全長35kb，位于第8號染色體近著絲點處，有14個外顯子及13個內含子，轉錄1.4kb mRNA，其啟動子位于主要轉錄起始點的上游115bp內［1］。從酵母到哺乳類細胞的polβ均高度保守，并且廣泛分布于哺乳動物細胞核內，其表達產物是相對分子質量為39kD的單鏈小分子蛋白，是真核細胞中相對分子質量最小的DNA聚合酶。polβ主要參與DNA修復。一系列DNA體外復制實驗也證實polβ不參與DNA復制，它的主要功能是參與DNA損傷修復，尤其是堿基切除修復（BER），包括短片段和長片段BER，起催化DNA合成填補缺口以及從無嘌呤／嘧啶（AP）位點催化5′末端脫氧核糖磷酸殘基釋放的作用［2－3］。堿基切除修復是一種重要的真核DNA修復途徑，它可以除去DNA損傷，包括脫堿基位點氧化損傷，甲基化堿基［4］。

有研究表明，細胞中polβ基因的突變會導致異常polβ的產生，損害BER功能，也會增加抑癌基因、原癌基因以及其他控制生長的重要基因的突變頻率，從而增加腫瘤的發生概率。polβ是BER過程的重要組成部分，而BER又是異常基因修復的重要途徑，對于細胞的正常生長具有至關重要的作用。polβ異常的細胞會顯示BER的缺乏和對損傷堿基物質的敏感性增加。目前，已在直腸癌、前列腺癌、食管癌、胃癌、鼻咽癌等多種人類腫瘤組織中發現了polβ基因突變和（或）表達異常［5－9］。因此，有必要構建人突變型polβ基因真核表達載體，將其轉染入polβ基因敲除的EC 9706細胞，利用該細胞株可有效排除本底干擾，確保表達的是突變型的polβ基因，為進一步研究突變型polβ基因對食管癌細胞的生物學影響打下堅實的實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 材料 限制性內切酶BamHⅠ、ApaⅠ（Takara公司）；T4DNA 連 接 酶 （Promega 公 司 ）；pGEM-T-easy 克 隆 載 體（Promega公司）；質粒提取試劑盒、膠回收試劑盒均購自QIAGEN公司；異丙基－β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）、5-溴-4-氯-3-吲哚－β-D-半乳糖苷（X-Gal）購自Invitrogen公司；食管癌突變型及野生型 polβ基因 （Mpolβ及 Wpolβ）、大 腸桿菌 DH5α及TOP10、真核表達載體pcDNA4-C、polβ基因敲除的EC 9706細胞均由本實驗室保存；Hislink蛋白純化試劑盒購自Promega公司；G 418購自Gibco公司；脂質體（LipofectamineTM2000）購自Invitrogen公司；DMEM、胎牛血清購自杭州四季青生物工程研究所；引物合成及序列分析均由上海生工生物工程公司完成。

1.2 方法

1.2.1 引物設計 根據GenBank所提供的polβ基因序列設計 引 物，引 物 1：5′-TCG GAT CCA TGA GCA AAC GGA AGG CGC CGC AGG AG-3′（BamHⅠ）；引物2：5′-TTG GGC CCT CAT TCG CTC CGG TCC TTG GGT TCC C-3′（ApaⅠ）。

1.2.2 目的基因的擴增 PCR擴增polβ基因 以 Mpolβ及Wpolβ為模版，利用引物1、引物2進行PCR擴增，獲得含BamHⅠ、ApaⅠ酶切位點的目的基因。擴增的反應體系：10×緩沖液3μL，4×dNTP 2μL，引物1 0.5μL，引物2 0.5 μL，Taq DNA聚合酶0.5μL，Mini-H2O 18.5μL，模版 DNA 5μL，反應條件：94℃預變性5min，94℃變性45s，55℃退火45s，72℃延伸60s，35個反應循環，72℃最后延伸5min，產物于－20℃保存。PCR擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳，分別從瓊脂糖凝膠中回收目的基因。具體步驟按膠回收試劑盒說明操作。

1.2.3 克隆 將回收的Mpolβ及Wpolβ基因序列與Promega公司的質粒載體pGEM-T以摩爾比3∶1的比例混合連接，連接產物16℃過夜，構建含有目的基因的重組質粒pGEM-TMpolβ及 pGEM-T-Wpolβ，用 CaCl2法轉化大腸桿菌 TOP10株，通過藍白篩選，挑選白色菌落進行PCR鑒定，然后選取插入了目的片段的重組質粒進行測序鑒定，即獲得了陽性重組質粒pGEM-T-Mpolβ及pGEM-T-Wpolβ。

1.2.4 亞克隆 用小量質粒提取試劑盒提取質粒pcDNA4-C和鑒 定 正 確 的 pGEM-T-Mpolβ 及 pGEM-T-Wpolβ，分 別 經BamHⅠ、ApaⅠ雙酶切后膠回收純化。具體步驟參照膠回收純化試劑盒。在T4DNA連接酶的作用下，16℃過夜，連接產物轉化大腸桿菌DH5α株感受態細胞，產生重組質粒pcDNA4-C-Mpolβ及pcDNA4-C-Wpolβ。經PCR鑒定，選取鑒定正確細菌，接種于30mL含氨芐西林的液體培養基中擴菌，用質粒提取試劑盒提取質粒即得重組質粒。

1.2.5 細胞轉染和蛋白純化 將本實驗室先前構建的質粒pcDNA4-C-Mpolβ和pcDNA4-C-Wpolβ分別以脂質體包裹的方式轉染入polβ基因敲除的EC 9706細胞，轉染6h后換為含100mL／LBSA的DMEM完全培養基繼續培養，繼續培養24h后G 418篩選2周，G418篩選濃度為700μg／μL，得到穩定表達pcDNA4-C-Mpolβ，pcDNA4-C-Wpolβ的細胞克隆，收集穩定轉染的細胞使用HislinTM蛋白純化試劑盒純化蛋白。

2 結 果

2.1 polβ基因的擴增 以 Mpolβ及 Wpolβ為模板，利用引物1、引物2經PCR擴增獲得polβ基因序列，在DNA marker 1 000bp處有條帶，可能為1 100bp的目的片段，與該片段的理論值一致，見圖1。

2.2 polβ基因片段的克隆及PCR鑒定 重組質粒pGEM-TMpolβ及pGEM-T-Wpolβ經轉化擴增后，經藍白篩選后分別從兩個氨芐西林陽性的平板上隨機篩選3個菌落，分別以6個菌落的裂解產物為模板，擴增片段長度大致為1 100bp，與預期結果相符，見圖2。

圖1 PCR擴增電泳結果

圖2 pGEM-T-Mpolβ／Wpolβ質粒PCR鑒定結果

圖3 重組質粒pcDNA4-C-polβPCR擴增產物電泳結果

2.3 測序及分析結果 含點突變片段的重組質粒與標本中的突變完全一致，構建載體中外源片段完全忠實于所選標本，可應用于下游操作。

2.4 polβ基因片段表達載體的構建及鑒定 T4連接酶分別連接雙黏的Mpolβ及Wpolβ基因和羥基化后雙黏的pcDNA4-C，轉化入感受態細胞DH5α，從每個氨芐西林陽性的平板上隨機挑選2個菌落溶菌進行PCR鑒定，電泳結果與設計一致，見圖3。

2.5 細胞轉染后polβ蛋白的純化 表達產物經SDS-PAGE分析，結果顯示，在相對分子質量約為39kD位置有一條帶，與預期的融合蛋白大小相符，說明誘導表達及純化成功，見圖4。

圖4 純化后蛋白SDS-PAGE結果

3 討 論

polβ基因和腫瘤之間的關系正受到越來越多的關注，很多的研究證明它參與了腫瘤的發生和發展，polβ基因突變已經在人類結腸直腸癌、前列腺癌、肺癌、乳腺癌、小鼠淋巴瘤中得到證實。迄今為止，只有90種腫瘤接受突變與聚合酶β編碼序列關系的分析，其中35%的腫瘤有polβ基因突變，這種與腫瘤有關的polβ基因突變只在腫瘤組織中發現，而在同一患者的正常組織中未發現polβ突變，這暗示了polβ基因突變是引起腫瘤疾病的自發突變，此外，在這些腫瘤中存在的polβ基因突變在124個正常個體的polβ基因中都未出現。更有意思的是：polβ定位于8號染色體（p12～p11）短臂的近側區，這個區段在一些人類腫瘤（如結腸直腸癌，前列腺癌）中經常丟失［10］。這些研究表明polβ基因突變和致癌作用間有一定的聯系。另一個與polβ在腫瘤中作用相一致的證據就是它與腫瘤抑制因子P53的相互作用［11－12］。P53蛋白可以在一個脫堿基位點穩定polβ，P53和polβ相互作用的改變會引起DNA修復效率的降低，而這可能導致腫瘤疾病的進展，如果在人類細胞表達87個堿基缺失的polβ基因突變（這種突變已經在原發結腸癌、肺癌、乳腺癌中發現［13］），它會比野生型polβ占優勢，并且會破壞它的堿基切除活性，很可能在其他的腫瘤樣本中發現的polβ基因突變有相似的生物學影響。因此，進一步研究polβ及其在DNA修復中作用的規律和機制已經成為腫瘤分子機制深入研究中一個新的領域。本實驗室曾發現在食管癌高發區及非高發區食管癌患者中有polβ基因的突變，且其突變形式與已報道的在其他腫瘤中polβ基因的突變形式不盡相同［14－15］。作為該課題的后繼研究，本實驗選擇突變型基因片段構建真核表達載體，為研究突變型polβ的功能及其對腫瘤的影響等作準備。構建突變型pcDNA4-C-polβ真核表達載體并純化出polβ蛋白可繼續進行其他研究，進而深入探討polβ基因突變及功能突變與環境、遺傳因素等的關系。

［1］ 董子明.DNA聚合酶β的研究現狀［J］.鄭州大學學報，2003，38（4）：477.

［2］ Wood RD，Mitchell M，Sgouros J，et al.Human DNA repair genes［J］.Science，2001，291（5507）：1284-1289.

［3］ 鹿偉，傅劍云.DNA聚合酶β與腫瘤關系的研究進展［J］.現代預防醫學，2006，33（12）：2344.

［4］ Lindahl T.Keynote：past，present，and future aspects of base excision repair［J］.Prog Nucleic Acid Res Mol Biol，2001，68：xvii-xxxx.

［5］ Bhattacharyy N，Chen HC，Wang L，et al.Heterogeneity in expression of DNA polymerase beta and DNA repair activity in human tumor cell lines［J］.Gene Expr，2002，10（3）：115.

［6］ 王蕾，董子明，趙國強.siRNA沉默DNA聚合酶β基因對胃癌BGC-823細胞增殖的影響［J］.腫瘤，2008，28（8）：651.

［7］ Starcevic D，Dalal S，Saeasy JB.Is there a link between DNA polymerase beta and cancer［J］.Cell Cycle，2004，3（8）：998.

［8］ Podlutsky AJ，Dianova II，Wilson SH，et al.DNA Synthesis and dRPase activities of Polymerase beta Are Both Essential for Single-Nucleotide Patch Base Excision Repair in Mammalian Cell Extracts［J］.Biochemistry，2001，40（3）：809-813.

［9］ Tieming L，Mausumi M，Daniela S，et al.A DNA polymerase mutant from colon cancer cells inducesmutations［J］.PNAS，2004，101（16）：6074-6079.

［10］Macoska JA，Trybus TM，Sakr WA，et al.Fluorescence in situ hybridization analysis of 8p allelic loss and chromosome 8instability in human prostate cancer［J］.Cancer Res，1994，54（14）：3824-3830.

［11］Seo YR，Fishel ML，Amundson S，et al.Implication of p53 in base excision DNA repair：in vivo evidence［J］.Oncogene，2002，21（5）：731-737.

［12］Zhou J，Ahn J，Wilson SH，et al.A role for p53in base excision repair［J］.EMBO J，2001，20：914-923.

［13］Bhattacharyya N，Chen HC.Variant forms of DNA polymerase beta in primary lung carcinomas［J］.DNA Cell Biol，1999，18（7）：549-554.

［14］劉棟，董子明，趙國強.食管癌DNA聚合酶β的突變［J］.河南職工醫學院學報，2002，14（4）：289.

［15］趙國強，鄭乃剛，趙勤，等.人食管癌組織中DNA聚合酶β基因突變特點分析［J］.鄭州大學學報，2003，38（4）：499.