Tjp-2沉默增強胰腺癌細胞解離及侵襲能力＊

王 巍，李 晴，曹志明，孫宏治，丁 峰，李 強，李東升，楊 濤，白 光△

（1.遼寧醫(yī)學院附屬第一醫(yī)院普外科，遼寧錦州 121001；2.遼寧醫(yī)學院附屬第三醫(yī)院消化內(nèi)科 121001；3.遼寧省錦州市緊急醫(yī)療救援中心 121001）

胰腺癌是消化道常見的惡性腫瘤之一，是惡性腫瘤中最常見的，多發(fā)生于胰頭部。其發(fā)病率雖只占各種腫瘤的1%～2%，占消化系統(tǒng)惡性腫瘤的8%～16%，呈逐年增長的趨勢。由于胰腺癌發(fā)病隱匿，早期多無明顯癥狀，或僅出現(xiàn)某些非特異性癥狀，加之又缺乏簡單、特異性的診斷方法，因此，多數(shù)患者就診時已為中、晚期。胰腺癌的5年生存率小于5%，目前仍然是預后最差的實體腫瘤［1］。目前手術仍是惟一可能治愈的方法，但是大多數(shù)患者就診時已屬中、晚期，手術切除率低［2］。

在近期研究中，應用cDNA微陣列分析檢測發(fā)現(xiàn)Tjp－2（又名zonula occludens-2，ZO-2）是一種在解離型高轉移株PC－1.0細胞和非解離型低轉移株PC-1細胞中的表達不同且與侵襲轉移關系密切的基因［3］。緊密連接是連接復合物中最靠近頂點的成分，通過在細胞間形成連續(xù)的帶狀結構隔離了頂點和側質膜。緊密連接由不同的跨膜蛋白包括occludin，claudin和JAMs組成，這些跨膜蛋白通過腳手架蛋白如ZO蛋白與細胞骨架相連。ZO蛋白（ZO-1、ZO-2、ZO-3）屬于膜相關的鳥苷酸激酶（MAGUK）家族，這些蛋白含幾個蛋白－蛋白相互作用的結構域，包括3個PDZ結構域、一個SH3結構域和一個GK結構域，它們主要定位于連接復合物的膜下區(qū)，把多個完整的膜蛋白交聯(lián)到細胞質表面，產(chǎn)生特殊的膜區(qū)域。Tjp家族有3名成員，分 別 為 Tjp-1（ZO-1）、Tjp-2（ZO-2）和 Tjp-3（ZO-3）。Tjps屬于膜相關MAGUK的同分異構體，參與組成上皮和內(nèi)皮細胞內(nèi)結構。Tjp與連接轉膜蛋白的胞質側C端綁定，使其與細胞骨架肌動蛋白和信號轉導通路成分連接［4］。Paris等［5］已鑒定的一種跨膜蛋白Occludin，可能提供了這些結構的基礎，用來源于肌酐肝組織此連接的單克隆抗體鑒定通過免疫電子顯微鏡觀察這種跨膜蛋白專一性地定位于許多不同類型細胞的緊密連接處。Occludin的拓撲學結構表明它的氨基端（－NH）和羧基端（－COOH）處于胞質側，兩個胞外環(huán)伸展向細胞間隙。目前，認為Occludin功能廣泛，在細胞間黏附、移動及調節(jié)細胞的通透性等方面起作用。Occludin也可直指參與腦微血管內(nèi)細胞上的Tjp形成［6］。但是Tjp參與腫瘤侵襲轉移，尤其是與細胞解離相關的機制尚未明確。

本實驗通過分析Tjp-2基因siRNA轉染后胰腺癌細胞解離狀態(tài)和侵襲能力的變化，擬證明Tjp-2表達與胰腺癌細胞解離及侵襲能力密切相關，為臨床上開發(fā)新的靶向治療藥物提供新的靶點。

1 材料與方法

1.1 材料 本實驗采用倉鼠胰腺癌細胞系PC-1，低轉移型PC-1細胞系是由利用BOP誘導的敘利亞倉鼠實驗性胰腺癌模型建立，以RPMI-1640培養(yǎng)液培養(yǎng)，并加10%胎牛血清、100 U／mL青霉素G和100μg／mL鏈霉素，于含5%CO237℃孵箱內(nèi)培養(yǎng)。

1.2 方法

1.2.1 基因轉染 TJP-2siRNA（sc-29926）由美國Santa Cruz公司設計并合成，選定3個針對不同位點的TJP-2siRNA序列，均已有實驗證明轉染效率大于75%。Control siRNA為陰性對照，由美國Santa Cruz公司合成購買；脂質體2000和Opti-MEN培養(yǎng)基均購于Invitrogen公司。實驗分組：對照組（Opti-MEN培養(yǎng)基＋PC-1細胞），陰性對照組（Opti-MEN 培養(yǎng)基＋control siRNA＋PC-1細胞），轉染組（Opti-MEN培養(yǎng)基＋TJP-2siRNA＋PC-1細胞）。

1.2.2 總RNA的提取及RT-PCR測轉染率 Trizol購自Invitrogen公司，RT-PCR試劑盒購于大連TaKaRa公司。轉染48h后提取總 RNA，TJP-2（245bp）：5′-GCA GAG CGA ACG AAG AGT ATG G（forward）、5′-TGA CGG GAT GTT GAT GAG GGT（reverse）；β-actin（664bp）：5′-GTG GGG CGC CCC AGG CAC CA（forward），5′-CTC CTT AAG TCA CGC ACG ATT CC（reverse）。PCR反應條件如下，95℃應變性5min，然后94℃30個循環(huán)20s，接著63℃退火30s、72℃延伸1 min，最后72℃7min延伸.PCR產(chǎn)物經(jīng)過1.5%含有溴化乙錠的瓊脂糖凝膠電泳并顯影，電壓為120V，電泳時間為40 min，凝膠成像系統(tǒng)對條帶進行掃描分析，計算灰度，以目的條帶與β-actin灰度的比值表示目的條帶的表達水平，轉染抑制率＝（轉染前表達水平－轉染后表達水平）／轉染前表達水平×100%。

1.2.3 Westernblot檢測 實驗以兔多克隆抗體作用于人Tjp-2氨基酸序列及β-actin（Santa Cruz，CA）作為一抗，利用辣根過氧化物酶結合的抗體和FITC標記的熒光抗體（Santa Caruz，CA）作為第二抗體。裂解各組細胞制備蛋白樣本后，取20 g裂解提取物用聚丙烯酰胺平板凝膠電泳，再將蛋白質轉印到PVDF膜上，然后將PVDF膜與0.1%Tween-20／PBS稀釋的一抗共同于4℃下孵育過夜，一抗孵育后的膜與辣根過氧化物酶標記的二抗以1∶2 000比例再加0.1%Tween-20／PBS稀釋共同孵育，利用Kodak scientific imaging film（eastman kodak company，rochester，NY），加入增強型化學發(fā)光劑（Santa Cruz，CA）以探測收集蛋白條帶光信號。

1.2.4 細胞解離狀態(tài) 6孔板中的細胞達到70%～80%融合時，用Papanicolaou′S染色法對各組細胞進行染色，鏡下觀察細胞解離狀態(tài)。

1.2.5 侵襲能力 Transwell小室分析侵襲能力 Transwell小室（costar，camb ridge，MA，USA）放入24孔細胞培養(yǎng)板中，另將含有25.6μg Matrigel的50μL RPMI-1640培養(yǎng)基加到上層小室的微孔濾膜上（直徑為8μm），37℃放置2h使其形成凝膠狀。各組細胞用無血清的RPMI-1640培養(yǎng)液洗滌后，用吸管吹打懸浮、計數(shù)、離心。按1×106／mL將細胞重懸于含0.1%牛血清清蛋白的RPMI-1640培養(yǎng)液中，取100μL細胞懸液加到小室的基底膜上，小室下層加800μL含0.1%牛血清清蛋白的RPM I-1640培養(yǎng)液，37℃，5%CO2培養(yǎng)20h。取出小室，吸棄小室內(nèi)的培養(yǎng)液，并用棉簽仔細拭出小室內(nèi)的細胞和人工基底膜，進行Diff-Quik染色。顯微鏡下觀察侵襲移動到多孔濾膜外側面上的細胞，隨機計數(shù)5個視野內(nèi)的細胞數(shù)，計算平均值。

1.3 統(tǒng)計學處理 采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件，利用非配對Student′st檢驗分析數(shù)據(jù)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 RT-PCR 轉染48h后，siRNA組的mRNA表達水平顯著降低，與陰性對照組相比下降了84.37%，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），見圖1。

圖1 TJP-2siRNA轉染后的mRNA結果

2.2 Westernblot 結果顯示Tjp-2蛋白表達在對照組和陰性對照組胰腺癌細胞中高表達，而在轉染組胰腺癌細胞中低表達，與陰性對照組比較下降了92.32%，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），見圖2。

圖2 TJP-2siRNA轉染后的蛋白表達結果

2.3 細胞解離狀態(tài) Papanicolaou′S染色，鏡下觀察細胞解離狀態(tài)，發(fā)現(xiàn)對照組及陰性對照組胰腺癌細胞PC-1均呈島樣克隆細胞生長，對照組及陰性對照組每個視野解離細胞數(shù)分別為

2個、2個，而siRNA轉染后48h每個視野的細胞解離狀態(tài)發(fā)生變化開始呈散在單個細胞生長，轉染組為每個視野6個解離細胞，轉染后解離細胞數(shù)明顯增多，見圖3。

圖3 各組胰腺癌細胞的解離狀態(tài)

圖4 胰腺癌侵襲能力比較

2.4 Transwell小室方法分析侵襲能力 將細胞加入含Matrigel的Transwell上室培養(yǎng)24h，Diff-Quik染色后鏡下觀察細胞并計數(shù)隨機5個視野（×200）內(nèi)細胞數(shù)，發(fā)現(xiàn)對照組、陰性對照侵襲細胞數(shù)分別為（20.2±2.59）、（19.6±1.14）個，而轉染 TJP-2siRNA后為（37.4±1.14）個，侵襲細胞數(shù)明顯增加，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見表1、圖4。

表1 各組胰腺癌細胞侵襲細胞數(shù)比較（n）

3 討 論

近年來，隨著對胰腺癌發(fā)生的分子機制研究的不斷深入，分子靶向治療成為研究的熱點。新生的靶向藥物由于成功治療了慢性白血病和乳腺癌、結腸癌，點燃了胰腺癌治療的新希望。為改善胰腺癌預后，針對胰腺癌高度的侵襲轉移特性，開發(fā)抑制胰腺癌侵襲轉移的新型靶向治療藥物是當務之急。通過抑制胰腺癌的侵襲轉移，使腫瘤限定于局部，再配合手術切除局部腫瘤，可能是根治胰腺癌值得探索的一條新途徑。最近，緊密連接在細胞生物學方面的進展 ，揭示了緊密連接的屏障功能和防御功能，表明以緊密連接蛋白作為藥物開發(fā)的靶標有著廣闊的前景。

與緊密連接相關的幾個胞質蛋白中，ZO-1、Tjp-2最具特征性。1986年通過用緊密連接片段免疫鼠肝細胞形成的特異性單克隆抗體鑒定了ZO-1。ZO-1在緊密連接、腎小球表皮細胞過濾孔和一些鈣粘素連接中均有發(fā)現(xiàn)。由于ZO-1，Tjp-2的多種異構體形式的存在不同細胞類型的緊密連接意義不同。ZO-1和Tjp-2之間相互作用，ZO-1結合于Occludin的羧基端（－COOH）。ZO-1和Tjp-2均屬于膜連接MAGUK家族。此蛋白質家族成員多數(shù)位于細胞之間的連接處并且與細胞骨架通過胞外信號轉導途徑相互作用，Tjp-2可能與MEK信號轉導通路密切相關［7］。近來研究表明ZO-1與乳腺癌的發(fā)生密切相關［8］，ZO-2是急性白血病的致癌因子［9］。有研究表明 ZO可能與血瘤屏障有關［10］，ZO-1在黏膜屏障中具有重要作用［11］。而研究表明 Tjp-2在胰腺癌和乳腺癌中表達失調［12］。

本研究表明，轉染前后光鏡下細胞的解離狀態(tài)也有差異，轉染處理后的PC-1細胞Tjp-2表達明顯降低，胰腺癌細胞的解離狀態(tài)也相應改變，從原來的島樣克隆式生長變?yōu)閱蝹€散在方式生長。證明Tjp-2表達與倉鼠的胰腺癌細胞的細胞解離狀態(tài)密切相關。當siRNA轉染處理PC-1后，在細胞膜細胞間連接處的Tjp-2表達明顯減弱，從而導致胰腺癌細胞解離，Transwell實驗結果證明其侵襲能力相應增強。所以，在倉鼠的胰腺癌細胞中Tjp-2的表達變化與胰腺癌細胞的侵襲轉移能力密切相關，且成負相關，基因沉默Tjp-2后胰腺癌細胞開始解離且侵襲轉移能力增強。且有研究證明Tjp-2蛋白可被磷酸化，Tjp-2磷酸化狀態(tài)的改變可能調控其細胞內(nèi)定位［13－15］。所以筆者推測Tjp-2的磷酸化狀態(tài)變化可通過MEK／ERK信號轉導通路進行調控，Tjp-2磷酸化在胰腺癌調控機制中的作用需進一步更深入的研究。

綜上所述，通過siRNA轉染PC-1細胞后對Tjp-2表達和細胞解離、侵襲能力的研究證明Tjp-2的表達與胰腺癌細胞解離狀態(tài)密切相關，并且可以調控胰腺癌細胞的侵襲及轉移能力。Tjp-2作為胰腺癌重要的腫瘤標記物，為開發(fā)新的抗胰腺癌侵襲轉移的分子靶向治療方法提供了重要的理論依據(jù)。

［1］Jemal A，Siegel R，Ward E，et al.Cancer statistics［J］.CA Cancer J Clin，2007，57（1）：43.

［2］ Loos M，Kleeff J，F(xiàn)riess H，et al.Surgical treatment of pancreatic cancer［J］.Ann N Y Acad Sci，2008，9（1138）：169.

［3］ Tan X，Zhou L，Wang W，et al.Genomic analysis of invasion-metastasis related factors in pancreatic cancer cells［J］.Exp Ther Med，2010，1（1）：211.

［4］ Lapierre LA.The molecular structure of the tight junction［J］.Adv Drug Deliv Rev，2000，41（3）：255.

［5］ Paris L，Tonutti L，Vannini C，et al.Structural organization of the tight junctions［J］.Biochim Biophys Acts，2008，1778（3）：646-659.

［6］ Dimitrijevicl OB，Stamatovicl SM，Keep RF，et al.Effects of the chemokine CCL2on blood-brain barrier permeability during ischemia-reperfusion ［J］.J Cereb Blood Flow Metab，2006，26（6）：797-810.

［7］ Patibandla PK，Tyagi N，Dean WL，et al.Fibrinogen Induces Alterations of Endothelial Cell Tight Junction Proteins［J］.J Cell Physiol，2009，221（1）：195-203.

［8］ Hoover KB，Liao SY，Bryant PJ.Loss of the Tight Junction MAGUK ZO-1in Breast Cancer Relationship to Glandular Differentiation and Loss of Heterozygosity［J］.Am J Pathol，1998，153（6）：1767-1773.

［9］ Prasad R，Gu Y，Alder H，et al.Cloning of the ALL-1fusion partner，the AF-6gene，involved in acute myeloid leukemias with thet（6；11）chromosome translocation［J］.Cancer Res，1993，53（23）：5624-5628.

［10］Xie H，Xue YX，Liu LB，et al.Endothelial-monocyte-activating polypeptide II increases blood-tumor barrier permeability by down-regulating the expression levels of tight junction associated proteins［J］.Rain Res，2010，10（1319）：13-20.

［11］Huang XH，Zhang L，Gao ZM，et al.Expression of occludin and zona occluden-1and their morphologic changes in vagina mucosal cells in patients undergoing vaginal construction by using sigmoid colon［J］.Zhong Hua Fu Chan Ke Za Zhi，2009，44（8）：588-592.

［12］Chlenski A，Ketels KV，Korovaitseva GI，et al.Organization and expression of the human zo-2gene（tjp-2）in normal and neoplastic tissues［J］.Biochim Biophys Acta，2000，1493（3）：319-324.

［13］Sabath E，Negoro H，Beaudry S，et al.Galpha12regulates protein interactions within the MDCK cell tight junction and inhibits tight-junction assembly［J］.J Cell Sci，2008，121（6）：814-824.

［14］Tsukamoto T，Nigam SK.Role of tyrosine phosphorylation in the reassembly of occluding and other tight junction proteins［J］.Am J Physiol，1999，276（5）：F737-750.

［15］Adachi M，Inoko A，Hata M，et al.Normal establishment of epithelial tight junctions in mice and cultured cells lacking expression of ZO-3，a tight-junction MAGUK protein［J］.Mol Cell Biol，2006，26（23）：9003-9015.