Survivin反義核苷酸對宣威肺腺癌移植瘤裸鼠模型作用的研究＊

王巍煒，洪志鵬，李高峰△，王紹佳，陳瑞彬，張繼朋

（1.昆明醫(yī)學(xué)院第三附屬醫(yī)院胸外科／云南省腫瘤醫(yī)院肺癌研究中心 650118；2.昆明醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院胸外科 650032；3.昆明醫(yī)學(xué)院第三附屬醫(yī)院婦科腫瘤科 650118）

宣威地區(qū)一直是西南、乃至全國的肺癌高發(fā)地區(qū)，其發(fā)病率和病死率一直高居不下，肺癌防控面臨著嚴峻的挑戰(zhàn)。前期研究發(fā)現(xiàn)宣威地區(qū)肺腺癌患者中survivin高表達，研究人員利用survivin反義核苷酸（ASODN）抑制宣威肺腺癌細胞取得了較好的效果［1－2］。在前期研究基礎(chǔ)上本研究采用體外培養(yǎng)宣威肺腺癌細胞XWLC-05細胞皮下接種法，在裸鼠體內(nèi)建立皮下宣威肺腺癌細胞XWLC-05細胞移植瘤模型。通過皮下移植瘤內(nèi)多點注射，觀察survivinASODN對肺癌移植瘤生長影響的情況，為下一步臨床研究提供實驗室依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 survivinASODN的合成和主要試劑 參照文獻［3］針對位于survivinmRNA 232～251bp處的序列，合成ASODN：5′-CCC AGC CTT CCA GCT CCT TG-3′和 正 義 寡 核 苷 酸（SODN）：5′-CAA GGA GCT GGA AGG CTG GG-3′。序列兩端堿基經(jīng)硫代修飾對抗核酸酶的降解，經(jīng)計算機網(wǎng)上檢索證實與survivin以外的己知人類基因無同源性。序列由上海生物

1.7 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS16.0統(tǒng)計軟件包處理數(shù)據(jù)。計量數(shù)據(jù)均以±s表示。各組間比較應(yīng)用方差分析最小顯著差法（F檢驗，α＝0.05），以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 4組裸鼠一般情況 整個實驗期間4組裸鼠未出現(xiàn)死亡，大、小便及飲食情況正常，活動度等未出現(xiàn)其他明顯的異常情況。處死后對各組裸鼠心臟、肝臟、腎臟進行病理檢查均沒有發(fā)現(xiàn)明顯變性壞死表現(xiàn)。

2.2 裸鼠腫瘤的體積及生長指數(shù)變化情況 survivinASODN治療組其腫瘤生長速度較為緩慢，其中部分裸鼠表現(xiàn)為腫瘤停止生長，甚至其中3只出現(xiàn)腫瘤退縮消失。治療結(jié)束后survivinASODN注射組瘤體的腫瘤大小明顯低于其他3組，而其他3組相似。survivinASODN治療組腫瘤生長指數(shù)為（2.78±0.27），遠遠低于對照組（5.71±0.31）、LIP組（6.21±0.23）和survivinSODN組（5.69±0.37），見圖1。

2.3 裸鼠腫瘤的質(zhì)量變化及抑瘤率情況 末次survivinASODN注射后第2周以脫臼法斷頸處死所有荷瘤裸鼠，提取腫瘤并且稱取質(zhì)量。可以發(fā)現(xiàn)survivinASODN注射組瘤體的腫瘤質(zhì)量為（1.06±0.04）g，低于對照組（2.22±0.03）g、LIP組工程公司幫助合成。細胞培養(yǎng)采用RPMI-1640培養(yǎng)基（Gibeo公司）；新生小牛血清采用杭州四季青生物公司產(chǎn)品。

1.2 細胞培養(yǎng) 選取云南宣威肺腺癌細胞株XWLC-05，由昆明醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院臨床醫(yī)學(xué)實驗研究中心提供。將其于－80℃冰箱中將保存后取出、后培養(yǎng)、傳代，最后將處于對數(shù)生長期的細胞進行實驗。

1.3 移植瘤裸鼠模型的建立 4～6周齡BALB／C裸小鼠，體質(zhì)量18～22g，雌、雄均可，購于昆明醫(yī)學(xué)院動物中心，飼養(yǎng)于SPF級無菌飼養(yǎng)室，自由攝取食物和水。采用培養(yǎng)細胞皮下接種移植法。對XWLC-05細胞常規(guī)傳代培養(yǎng)1個月左右，于接種當(dāng)日收集大量的培養(yǎng)細胞后，立即接種，接種細胞數(shù)量為2.0×106（約0.5mL懸液），用1mL注射器將單細胞懸液注射于裸鼠左前腋側(cè)皮下。

1.4 實驗分組及survivinASODN注射 將一批實驗用裸鼠接種后至腫瘤最長徑達8～10mm時，隨機挑選其中48只，隨機分4組，每組12只。對照組：予生理鹽水處理；單純脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染（LIP）組：予等量的脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染液處理；survivinSODN組：予600nmol／L survivinSODN 脂質(zhì)體復(fù)合物處理；survivinASODN組：予600nmol／L survivinASODN脂質(zhì)體復(fù)合物處理。各組分別于成瘤分組后每隔48h按直接移植瘤內(nèi)多點注射1次，共注射5次。

1.5 XWLC-05裸小鼠皮下移植瘤體積、質(zhì)量及腫瘤生長抑制率的測定 分別于每次注射前用游標(biāo)卡尺測量腫瘤最長徑和最短徑，并稱體質(zhì)量。于末次survivinASODN注射后第2周以脫臼法斷頸處死所有荷瘤裸鼠，取移植瘤測量腫瘤最長徑（a）和最短徑（b），按公式v＝ab2／2計算腫瘤體積，計算腫瘤生長指數(shù)：（V治療后－V治療前）／V治療前。稱取瘤結(jié)節(jié)質(zhì)量，以瘤結(jié)節(jié)質(zhì)量計算抑瘤率：抑瘤率（%）＝（對照組質(zhì)量－實驗組質(zhì)量）／對照組質(zhì)量×100%。

1.6 一般狀況觀察及組織學(xué)檢查 觀察包括裸鼠的飲食、大小便、精神狀況等。處死裸鼠后標(biāo)本固定后，留取心臟、肝臟、腎臟和腫瘤組織用4%多聚甲醛固定后在光鏡下觀察腫瘤細胞壞死、凋亡、炎癥反應(yīng)等改變。（2.61±0.04）g和survivinSODN 組（2.69±0.05）g，survivin ASODN抑瘤率為（37.26±1.92）%，見圖2。

圖1 survivinASODN轉(zhuǎn)染對裸鼠移植瘤腫瘤生長指數(shù)的影響

圖2 survivinASODN轉(zhuǎn)染對裸鼠移植瘤腫瘤質(zhì)量的影響

2.4 survivinASODN轉(zhuǎn)染對裸鼠腫瘤組織的影響 對照組、LIP組和survivinSODN組細胞體積大，大小不等，胞漿豐富，胞核大，深染，核分裂相多見，偶見瘤巨細胞。而survivinASODN處理組XWLC-05細胞形態(tài)與其他3組相似，但瘤組織中有大量的細胞壞死灶，結(jié)締組織增生，炎癥細胞浸潤明顯。

3 討 論

survivin基因是在人類基因組文庫中篩選克隆出IAP家族的一個新成員，在多種腫瘤中均有表達［4－5］。前期研究表明，和其他腫瘤細胞中情況相似［6－7］，通過對特定靶向基因的survivin的反義抑制，可以影響其基因、蛋白的表達，可抑制宣威肺腺癌細胞XWLC-05增殖并誘發(fā)其凋亡，從而抑制其生長［8］。本研究采用動物實驗的方法進一步研究survivinASODN對小鼠宣威肺腺癌轉(zhuǎn)移瘤的干預(yù)作用。采用反義技術(shù)，針對survivin基因232～251bp處的序列，合成反義寡核苷酸，并且采用脂質(zhì)體包裹、硫代磷酸修飾后將其直接多點注射于宣威肺腺癌細胞XWLC-05裸鼠皮下移植瘤內(nèi)。肉眼觀察發(fā)現(xiàn)survivinASODN組的腫瘤生長比較緩慢，其中部分裸鼠表現(xiàn)為腫瘤生長緩慢或者停止生長，甚至其中3只裸鼠出現(xiàn)腫瘤退縮消失。測量結(jié)果也顯示survivinASODN組瘤體生長指數(shù)（2.78±0.27）低于與對照組、LIP組和survivnSODN組。處死所有荷瘤裸鼠稱取其腫瘤質(zhì)量。可以發(fā)現(xiàn)survivinASODN注射組瘤體的腫瘤質(zhì)量為（1.06±0.04）g，低于其他3組，其抑瘤率高達（37.26±1.92）%。顯微鏡下觀察顯示，ASODN組液化壞死灶增多，凋亡細胞增加。提示，survivinASODN對宣威肺腺癌細胞XWLC-05裸鼠移植瘤產(chǎn)生了明顯的抑制作用，結(jié)合相關(guān)研究和本研究結(jié)果推測可能是由于survivinASODN干擾survivin的表達或抑制其功能的發(fā)揮，從而抑制有絲分裂并促進自發(fā)細胞凋亡，使腫瘤生長速度延緩，瘤體質(zhì)量減輕［9－10］。整個實驗過程中4組裸鼠均沒有出現(xiàn)死亡，大小便及飲食情況沒有發(fā)現(xiàn)明顯異常，處死后各組裸鼠心臟、肝臟、腎臟均沒有發(fā)現(xiàn)明顯變性、壞死表現(xiàn)。提示脂質(zhì)體、反義核酸對于裸鼠是安全的，這可能由于survivin僅特異性地表達于腫瘤組織［11－12］，而survivinASODN治療具有良好的靶向性、特異性，其對正常組織影響較小。

survivinASODN處理宣威肺腺癌細胞裸鼠肺癌細胞XWLC-05移植瘤后，腫瘤的生長明顯受到抑制，未出現(xiàn)明顯不良反應(yīng)，提示在宣威肺腺癌中采用反義核苷酸治療是安全、可行的［13－15］，為下一步臨床治療提供了思路和實驗室資料。

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