Anti HER2 ScFv-GFP融合抗體靶向檢測HER2的表達

高國輝，陳翀，楊艷梅，楊涵，王金丹，鄭易，黃奇迪，胡孝渠

1 溫州醫學院生命科學院 浙江省醫學遺傳學重點實驗室，浙江 溫州 325035

2 溫州醫學院附屬第一醫院腫瘤外科，浙江 溫州 325035

研究表明，30%左右的乳腺癌、胰腺癌等多種癌癥病人的癌組織細胞表達人表皮生長因子受體-2即HER2[1-4]。盡管HER2在癌細胞中表達率不高，但陽性的病例大多出現預后差、發展快、易早期轉移等特點。此外，HER2過表達的病例對多種化療、放療等表現出不敏感。因此，臨床上通過檢測癌組織中HER2的表達來預測癌病人的預后[5-8]。

目前，檢測HER2表達狀態的方法為3種：免疫組織化學法 (Immunohistochemistry，IHC)、熒光原位雜交法 (Fluorescence in situ hybridization，FISH) 和顯色原位雜交法(Chromogenic in situ hybridization，CISH)。免疫組織化學法將組織經福爾馬林固定、石蠟包埋及長時間儲存后易導致細胞膜表面蛋白降解。此外，觀察結果時觀察者之間的差異常常導致檢測結果產生誤差[9]。而熒光原位雜交法和顯色原位雜交法均操作繁瑣、耗時，需要配置專業的儀器設備[10-11]。因此，探索一種直觀、簡便、特異性強且無誤差的快速檢測方法應用于臨床分子實驗診斷HER2陽性腫瘤細胞十分必要。

本研究為探索攜帶綠色熒光的抗HER2單鏈抗體在 HER2陽性腫瘤的臨床診斷中的應用價值，把綠色熒光蛋白 (GFP) 基因與抗 HER2 ScFv基因拼接，利用pFast Bac HT A/sf9真核表達系統制備抗HER2 ScFv-GFP融合抗體，分離純化含有綠色熒光的抗HER2單鏈抗體，利用該融合抗體靶向性檢測兩種已認定的乳腺癌HER2陽性細胞BT474、SKBR3，以HER2陰性的MCF7為對照，比較攜帶綠色熒光的抗HER2單鏈抗體在HER2陽性腫瘤細胞檢測中的功能，同時，將其應用于臨床病理組織靶向檢測，探索攜帶綠色熒光的抗HER2單鏈抗體在臨床分子診斷HER2陽性腫瘤細胞中的可能性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 基因片段、菌種、載體與細胞株

桿狀病毒-昆蟲細胞表達系統 pFast Bac HT A/sf9由浙江大學張傳溪教授提供，鼠源性人抗HER2-ScFv片段由中山大學醫學院宋爾衛教授課題組提供，GFP片段由浙江大學生命科學院吳敏教授惠贈，DH10Bac、TG1等菌株由本實驗室保存，pGEM T Easy Vector購于Promega公司，腫瘤細胞株BT474、SKBR3、MCF7購于上海生物化學與細胞生物學研究所。乳腺癌臨床病理組織由溫州醫學院附屬第一醫院腫瘤外科提供。

1.1.2 工具酶及試劑盒

限制性內切酶EcoRⅠ、Hind Ⅲ、BamHⅠ、dNTPs、DNA Marker DL2000、中分子量蛋白Marker、DNA Marker 4500均為TaKaRa公司產品；T4 DNA連接酶、Taq DNA聚合酶、NC膜購于Promega公司；鼠抗GFP-Tag mAb、Goat Anti-Mouse IgG-HRP、DAB為Abmart公司產品；GFP標準品購于上海物競化學試劑部；DNA膠回收試劑盒、質粒抽提試劑盒購于Omega公司。

1.1.3 細胞培養基、抗生素及其他試劑

氨芐青霉素 (Ampicillin) (100 g/L)、卡那霉素 (Kanamycin) (100 g/L)、四環素 (Tetracyclin) (40 g/L)，慶大霉素 (Genlamycin) 35 g/L為國產試劑。DMEM高糖培養基、胎牛血清、RPMI 1640、胰酶培養液購自 GIBCO公司，昆蟲細胞培養基NTM-FH insect medium為Sigma公司產品。

1.2 方法

1.2.1 引物的設計與合成

根據Anti HER2 ScFv片段序列和GFP序列設計引物如表1所示。

Anti HER2 ScFv-R引物中抗HER2-ScFv片段的終止密碼子TAA被刪除掉。

1.2.2 融合基因Anti HER2 ScFv-GFP的構建

將Anti HER2 ScFv的PCR產物進行EcoRⅠ/ BamHⅠ雙酶切，GFP的PCR產物進行Hind Ⅲ/ BamHⅠ雙酶切，將2條均具有BamHⅠ粘性末端的酶切產物分別進行回收、純化，然后利用T4 DNA連接酶于16 ℃連接14 h左右，以連接產物為模板，以Anti HER2 ScFv-F為Anti HER2ScFv-GFP的上游引物，以 GFP-R為融合基因Anti HER2 ScFv-GFP的下游引物，PCR擴增，1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。獲得融合基因，將之克隆到pGEM T Easy載體，EcoRⅠ、Hind Ⅲ雙酶切鑒定陽性質粒后測序確認陽性質粒中融合基因序列，Blast比對序列的正確性。

表1 本研究中PCR所用的引物Table 1 PCR primers used in this study

1.2.3 真核表達載體重組子 pFast Bac HT A/Anti HER2 ScFv-GFP的構建

用 EcoRⅠ、Hind Ⅲ分別雙酶切 pGEM T Easy Vector/Anti HER2 ScFv-GFP、pFast Bac HT A，用 T4 DNA連接酶將 pFast Bac HT A與Anti HER2 ScFv-GFP在4 ℃連接過夜，連接產物轉化 TG1感受態細胞，氨芐青霉素抗性篩選，雙酶切鑒定重組子，并對重組子測序確認閱讀框的正確性。

1.2.4 重組Bacmid的獲得與鑒定

將鑒定好的陽性重組質粒 pFast Bac HT A/Anti HER2 ScFv-GFP轉化DH10Bac感受態細胞，37 ℃培養8 h后，涂布含IPTG、X-gal、卡那霉素、慶大霉素及四環素的LB平板，篩選白色菌落，在含有上述3種同樣抗生素的液體LB培養基中，37 ℃振蕩培養過夜，堿裂解法獲得重組病毒DNA，用M13通用引物進行PCR擴增，通過 PCR擴增法確定融合基因 Anti HER2 ScFv-GFP是否重組到Bacmid。

1.2.5 昆蟲細胞sf9的培養、轉染及重組病毒的感染

在35 mm細胞培養皿中接種1×106sf9細胞，加入2 mL有血清培養基，輕搖培養皿，使細胞分散均勻，27 ℃培養24 h。取兩支1.5 mL離心管分別配制溶液A (約2 μg重組桿狀病毒DNA溶于100 μL無血清培養基中) 和溶液 B (5 μL Lipoefectin稀釋于80 μL無血清培養基中)，合并溶液A和溶液B輕輕混勻，室溫靜置15 min。棄細胞培養液，并用無血清培養基洗 3次，加0.8 mL無血清培養基至Lipoefectin——DNA混合物中，輕輕混勻后，小心滴加到細胞表面，輕輕混勻。27℃培養8 h后，棄轉染液，加有血清培養基2 mL繼續培養。感染4 d后收集有明顯病毒感染癥狀的細胞上清，再感染sf9細胞3輪進行病毒擴增。熒光顯微鏡下觀察被感染的 sf9的變化。

1.2.6 表達產物的分離純化與濃度測定

取30 mL含有表達產物的經過第3輪感染的sf9細胞培養液離心后收集細胞，用100 mmol/L Tris-HC1 (pH 8.0) 重懸，在昆蟲細胞破碎前按照1∶1 000比例添加胰蛋白酶抑制劑 (Aprotinin)來防止蛋白酶的降解，冰浴中溫和超聲6次 (每次2 min，間隔10 s) 破碎，4 ℃、10 000×g離心5 min，收集上清，用Ni2+-NTA親合層析柱室溫結合1 h，用洗滌緩沖液 (100 mmol/L Tris-HC1，20 mmol/L咪唑，pH 8.0) 洗滌5次后，分別用含100、200、500 mmol/L的咪唑洗脫緩沖液洗脫，過0.45 μm濾膜除菌待用，考馬斯亮藍法測定收集的融合蛋白的濃度。

1.2.7 Western blotting分析融合抗體 Anti HER2 ScFv-GFP在昆蟲細胞中的表達

純化后的融合抗體樣品經SDS-PAGE分析，利用 Bandscan軟件計算純化的目的蛋白純度，然后電轉移至NC膜，以5 g/L脫脂奶粉室溫封閉1 h，依次加入鼠抗GFP-Tag mAb (1∶5 000稀釋，4 ℃孵育過夜) 為一抗，HRP標記的山羊抗小鼠IgG (1∶5 000稀釋，室溫2 h) 為二抗用化學發光試劑盒于暗室條件下感光顯影。分析蛋白質印跡結果。

1.2.8 Western blotting分析三種待測乳腺癌細胞株HER2表達狀態

取待檢測的乳腺癌細胞株SKBR3、BT474，MCF7細胞培養液各3 mL，離心后收集細胞，用100 mmol/L Tris-HC1 (pH 8.0) 重懸，冰浴中溫和超聲6次 (每次2 min，間隔10 s) 破碎，4 ℃、10 000×g離心5 min，收集上清，經SDS-PAGE分離后電轉移至NC膜，以5 g/L脫脂奶粉室溫封閉1 h，加入一抗鼠抗HER2mAb (1∶5 000稀釋)，4 ℃過夜，以HRP標記的山羊抗小鼠IgG (1∶5 000稀釋，室溫2 h) 為二抗用化學發光試劑盒于暗室條件下感光顯影，分析蛋白質印跡結果。

1.2.9 融合抗體 Anti HER2 ScFv-GFP不同時間段檢測三種乳腺癌細胞株

胰酶消化生長鋪滿的乳腺癌細胞 SKBR3、BT474和MCF7，重懸于無胎牛血清的RPMI1640培養液，1∶5稀釋Anti HER2 ScFv-GFP融合蛋白樣品，37 ℃、50 mL/L CO2培養箱中培養2 h，調整細胞密度為5×108個/L，以1 mL/孔加入6孔細胞培養板，每孔 1 mL，設復孔為陰性洗脫對照，Anti HER2 ScFv與乳腺癌細胞SKBR3、BT474和MCF7細胞表面受體充分結合2 h，添加胎牛血清100 mL/L，37 ℃、50 mL/L CO2培養箱中培養，分別經過12、24、48 h混合孵育后，1×PBS洗3~5次。共聚焦顯微鏡觀察綠色熒光在SKBR3、BT474和 MCF7細胞表面受體分布情況，判斷攜帶綠色熒光的抗HER2單鏈抗體對這兩種陽性一種陰性的腫瘤細胞的鑒定能力及不同時間段的結合穩定性。根據檢測結果，將所取得的原始抗體溶液倍比稀釋后，分別與一定濃度的經過培養24 h HER2陽性腫瘤細胞SKBR3培養液混合孵育，能觀察到綠色熒光的最大倍比稀釋倍數就是該抗體的滴度。

1.2.10 融合抗體Anti HER2 ScFv-GFP檢測病理組織結果與免疫組織化學法檢測結果對比

取臨床9例標本的石蠟切片放置在60 ℃恒溫箱中烘烤2 h，然后置于二甲苯中浸泡10 min，更換二甲苯再次浸泡 10 min，無水乙醇中浸泡5 min，95%乙醇浸泡5 min，70%乙醇浸泡5 min，PBS洗2次，每次5 min，蒸餾水沖洗5 min。在微波爐里加熱 0.01 mol/L檸檬酸鹽緩沖液(pH 6.0)，沸騰后放入石蠟切片，斷電，間隔10 min，反復1~2次。蒸餾水洗5 min，PBS洗2次，各5 min，加3% H2O2孵育30 min (室溫)，PBS洗3次，各5 min，滴加正常山羊血清封閉液，室溫20 min，甩去多余液體，根據細胞水平上Anti HER2 ScFv-GFP融合蛋白結合細胞的濃度滴加蛋白樣品50 mL于切片上，置于4 ℃過夜，PBS洗3次，各5 min，封片，共聚焦顯微鏡觀察綠色熒光分布情況，分析該融合抗體的工作滴度。用S-P 法免疫組化 (Immunohistochemistry，IHC) 檢測HER2蛋白的表達。在光鏡下觀察時，需注意細胞膜完全著色的腫瘤細胞比例及著色強度，HER2蛋白表現為棕黃色顆粒，定位于細胞膜。根據HER2蛋白表達的強度進行評分，高倍顯微鏡下觀察10個視野，沒有染色或小于30 %的腫瘤細胞染色為陰性，大于30%的腫瘤細胞有不完整細胞膜著色為弱陽性 (+)，大于30%的腫瘤細胞有較弱但完整的細胞膜著色為陽性(++)，大于30%的腫瘤細胞較強完整細胞膜著色為強陽性 (+++)。

2 結果

2.1 融合基因Anti HER2 ScFv-GFP的構建

經PCR擴增獲得Anti HER2 ScFv片段在800 bp左右，GFP為700 bp左右 (圖1B)，將兩條同時具有BamHⅠ粘性末端的膠回收片段產物直接連接 (圖1A)，以連接產物為模板，PCR擴增獲得1 500 bp左右的融合基因 (圖1B)。融合基因克隆到 T載體后，測序表明整個融合基因為1 539 bp，Blast分析重組子中的融合基因序列與理論序列同源性為100%，表明融合基因構建成功。

2.2 真核表達載體 pFast Bac HT A/Anti HER2 ScFv-GFP的構建與重組Bacmid鑒定

雙酶切重組子 pFast Bac HT A/Anti HER2 ScFv-GFP，在1 500 bp有明顯條帶 (圖2A-1)，單酶切結果與理論序列長度一致 (圖 2A-2)，經測序結果完全正確，以M13通用引物進行PCR鑒定陽性Bacmid，結果在3 800 bp左右有明顯條帶(圖2B)，與預期相符合，融合基因Anti HER2 ScFv-GFP完全重組到Bacmid上。

圖1 融合基因Anti HER2 ScFv-GFP的構建Fig. 1 Construction of the fusion gene Anti HER2 ScFv-GFP. (A) Schematic diagram of the fusion gene Anti HER2 ScFv-GFP. (B) M: marker; 1: PCR product of Anti HER2 ScFv; 2: PCR product of GFP; 3: PCR product of fusion gene Anti HER2 ScFv-GFP.

圖2 pFast Bac HT A/Anti HER2 ScFv-GFP的單、雙酶切鑒定與重組Bacmid的PCR鑒定Fig. 2 The restriction enzyme analysis of the recombinant pFast Bac HT A/Anti HER2 ScFv-GFP and the PCR production of positive recombinant bacmid. (A) M: marker; 1: the double digestion product of pFast Bac HT A/Anti HER2 ScFv-GFP positive plasmid; 2: the single digestion product of pFast Bac HT A/Anti HER2 ScFv-GFP positive plasmid. (B) M: marker; 1: the PCR product of the recombinant bacmid containg fusion gene Anti HER2 ScFv-GFP.

2.3 融合基因Anti HER2 ScFv-GFP在sf9中的表達與Western blotting鑒定分析

用Lipoefectin介導轉染粉紋夜蛾細胞sf9細胞。5 d后有少量綠色熒光顯示 (圖3A-b)，預示融合基因在sf9細胞成功表達。分離獲得血清中的重組病毒顆粒，連續3輪感染昆蟲細胞sf9，通過熒光顯微鏡觀察發現在細胞內熒光蛋白越來越多，均勻分布在靠近細胞膜附近(如圖3A-c)。細胞破碎后離心的上清液經Ni2+-NTA親合層析純化后濃度測定為115.5 mg/L，純化蛋白樣品經 SDS-PAGE分離后結果表明是一條帶，Bandscan軟件計算純化的目的蛋白純度約97%，Western blotting結果表明有特異性條帶在60 kDa左右，與預期相符合 (圖3B)。

2.4 單克隆抗體Western blotting法檢測三種乳腺癌細胞株HER2表達狀態

三種乳腺癌細胞破碎物經過Western blotting分析，結果發現細胞株 SKBR3和 BT474在130~250 kDa之間有特異性條帶，與報道的HER2蛋白分子量約185 kDa相符合 (圖4)，表明細胞株SKBR3和BT474為HER2陽性腫瘤細胞株，而 MCF7無特異性條帶出現，表明該細胞株為HER2陰性。

圖3 融合基因Anti HER2 ScFv-GFP在sf9中的表達 (200×)Fig. 3 Expression and analysis of the fusion antibody Anti HER2 ScFv-GFP. (A) Expression of fusion protein Anti HER2 ScFv-GFP in insect cells sf9 (200×). A: negative control insect cells sf9 without transfected the recombinant bacmid; b: the result of sf9 cells transfected by the the recombinant bacmid; c: the result of sf9 cells infected by the the recombinant bacmid. (B) Western blotting analysis of the fusion protein Anti HER2 ScFv-GFP. M: marker; 1: the result of Western blotting.

2.5 融合抗體Anti HER2 ScFv-GFP檢測3種乳腺癌細胞株HER2表達狀態

激光共聚焦顯微鏡觀察發現 12 h后已認定為HER2陽性的乳腺癌細胞BT474、SKBR3表面有明顯的綠色熒光出現，并且不能被 PBS洗脫，而已認定為HER2陰性的乳腺癌細胞MCF7經過洗脫后細胞表面無綠色熒光存在 (圖5A)。GFP標準品陰性對照表明 GFP本身并沒有結合到細胞表面的能力 (圖5B)。

融合抗體與 3種乳腺癌細胞混合孵育 24 h后，激光共聚焦顯微鏡觀察發現已認定為HER2陽性的乳腺癌細胞 BT474、SKBR3表面仍然具有明顯的綠色熒光出現，并且不能被PBS洗脫，而已認定為HER2陰性的乳腺癌細胞MCF7經過洗脫后細胞表面仍然無綠色熒光存在 (圖6A)。 GFP標準品陰性對照表明 GFP本身并沒有結合到細胞表面的能力 (圖6B)。

圖4 Western blotting檢測3種乳腺癌細胞株HER2表達狀態Fig. 4 Western blotting analysis of the Anti HER2 antibody for HER2 positive cancer cells.

圖5 融合抗體在12 h后HER2的檢測結果 (200×)Fig. 5 Detection result of the fusion antibody testing HER2 after 12 h (200×).

融合抗體與 3種乳腺癌細胞混合孵育 48 h后，激光共聚焦顯微鏡觀察發現已認定為HER2陽性的乳腺癌細胞 BT474、SKBR3表面具有較弱的綠色熒光出現，也不能被PBS洗脫，而已認定為HER2陰性的乳腺癌細胞MCF7經過洗脫后細胞表面無綠色熒光存在 (圖7A)。GFP標準品陰性對照表明GFP本身并沒有結合到細胞表面的能力 (圖7B所示)。表明純化后的蛋白溶液在37 ℃細胞培養箱存放48 h仍然具有靶向檢測的能力。2倍稀釋法測定該純化的融合抗體滴度約為1∶64。

2.6 融合抗體Anti HER2 ScFv-GFP檢測病理組織結果與免疫組織化學法檢測結果對比

9例乳腺癌標本的同一組織分別用免疫組織化學法 (IHC) 和攜帶綠色熒光的融合抗體檢測臨床HER2的表達狀態，結果發現在激光共聚焦顯微鏡下觀察到IHC法檢測為CerbB-2(-)陰性的病理組織 3例，用融合抗體觀察不到綠色熒光(圖8A、B)，同理IHC法檢測為CerbB-2 (++) 的病理組織3例，用融合抗體檢測可以見到不是十分明顯的綠色存在 (圖8C、D)，而CerbB-2 (+++)的病理組織3例，用融合抗體檢測到明顯的綠色熒光存在 (圖8E、F)，與預計結果相符合。

圖6 融合抗體在24 h后HER2的檢測結果 (200×)Fig. 6 Detection result of the fusion antibody testing HER2 after 24 h (200×).

圖7 融合抗體在48 h后HER2的檢測結果 (200×)Fig. 7 Detection result of the fusion antibody testing HER2 after 48 h (200×).

圖8 免疫組織化學法檢測病理組織結果對比融合抗體Anti HER2 ScFv-GFP檢測病理組織結果 (100×)Fig. 8 Comparison of detection HER-2 in the same tumor samples using IHC and ScFv binding technique (100×).

3 討論

臨床上一般先通過檢測HER2是否為陽性來判斷是否給病人施用單克隆抗體藥物[12-14]。因此，創建一種精確度高、誤差小且方便的檢測HER2的方法對臨床治療措施的確定具有借鑒意義。

目前，HER2檢測主要是分析人17號染色體上的癌基因HER2的擴增水平或者腫瘤細胞表面HER2蛋白胞外區的分布量。免疫組化法 (IHC)通過一抗結合HER2蛋白胞外區后二抗結合一抗并激活底物反應顯色來觀察細胞膜被染色的比例。臨床上將HER2蛋白的表達強度進行分級為0、1+、2+、3+，其中2+和3+表示為陽性結果。但是，HER22+和3+的結果中用FISH技術檢測發現無HER2基因擴增的現象經常出現[15-16]。研究表明，標本的制備、正常組織上皮著色、細胞質著色、染色記數誤差等因素導致 20%左右的IHC檢測結果不可靠[17-18]。FISH技術是通過熒光標記的DNA探針與陽性細胞細胞核內的DNA靶序列雜交，在熒光顯微鏡下觀察細胞核內雜交于DNA靶序列的多種彩色信號，以獲得多種基因的狀態信息。FISH技術中的DNA探針一般將HER2基因和 17號染色體著絲粒序列包括在內構建混合探針，提高精確度。熒光原位雜交法(FISH) 比免疫組化法 (IHC) 明顯精確度高[19]。但是，DNA探針的選擇、PCR擴增過程的重復性、G2期細胞內的基因拷貝數目特征可能導致的計數誤差也會導致結果精確度下降。CISH技術使用地高辛標記的探針在甲醛固定、石蠟包埋組織的切片上進行雜交，然后用鼠抗地高辛抗體和辣根過氧化物酶-抗鼠抗體進行免疫結合、DAB顯色，觀察雜交結果。但是，也存在著加熱時間、消化時間難以控制而造成誤差的可能。

抗HER2的單鏈抗體具有特異性靶向結合腫瘤細胞表面HER2受體的特點，綠色熒光蛋白可作為報告基因來研究基因的表達、細胞分化及蛋白質在生物體內定位和轉運等。

本研究在前期工作基礎上，利用桿狀病毒-昆蟲細胞真核表達系統pFast Bac HT A/sf9表達獲得攜帶綠色熒光的抗HER2單鏈抗體，將該融合抗體應用于已被認定的 HER2陽性腫瘤細胞BT474和SKBR3，12 h和24 h后的檢測結果表明同一濃度的不同時間觀察，均能看到 BT474和SKBR3表面有強烈的綠色熒光出現，與已認定的結果相符合。而48 h后細胞表面綠色熒光變暗，推測為綠色熒光蛋白的自身弱化原因。張瑰紅等[20]在對比CISH和IHC對HER2檢測效果的研究中發現兩種方法檢測的結果符合率只有81.2%，而本研究中，兩種HER2陽性腫瘤細胞均能被檢出，HER2陰性結果不能被檢出，符合率達 100%。國外關于乳腺癌的研究統計 CISH和FISH的結果符合率在90%以上，但是仍然有誤差存在[21-24]，3種方法產生誤差的一個共同影響因素為染色。而利用攜帶綠色熒光的抗HER2單鏈抗體靶向結合 HER2陽性的細胞表面檢測HER2的表達狀態，可避免這個環節的出現從而提高檢測的精確度。

此外，檢測結果在12 h或24 h左右即可獲得，使用普通熒光顯微鏡或者激光共聚焦顯微鏡即可觀測到檢測結果，不需要特殊圖象軟件或者多種抗體參與檢測過程，而其他3種方法均有特殊的要求[25]。

在臨床實驗中，本研究用幾例臨床病理組織標本對比檢測結果，HER2的存在以及表達量與綠色熒光的分布及強弱有一定的相關性，但是將攜帶綠色熒光的融合抗體大量應用到臨床標本是否具有此規律仍然未知，該融合抗體的結合特異性和親和能力也需要驗證。

本實驗采用的腫瘤細胞 BT474、SKBR3和MCF7均為已認定HER2表達狀態，且為成熟細胞株，但是臨床上各種 HER2表達狀態的細胞類型還有很多，臨床價值的探索還要進一步深入研究。

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