慢性淋巴細胞白血病患者外周血p53基因突變觀察

朱家斌，周立濤，王曉煒，徐 衛，于 亮，李建勇

(1南京醫科大學附屬淮安第一醫院，江蘇淮安223300;2南京醫科大學第一附屬醫院)

慢性淋巴細胞白血病(CLL)臨床進程異質性較大，一些患者初診時即有臟器腫大、貧血等癥狀，需立即開始治療;另一些患者在整個疾病過程中無任何癥狀或體征，壽命與同年齡的健康人群類似。因此，對其相關預后指標的研究顯得極其重要。由于CLL的Binet或Rai 分期不能預測疾病早期是否進展，一些新的預測指標不斷被發現，如淋巴細胞倍增時間、乳酸脫氫酶、血清 β2-微球蛋白、可溶性CD23、胸苷激酶、分子遺傳學異常、CD38、ZAP-70、p53基因異常及免疫球蛋白重鏈可變區(IgVH)基因突變等［1～4］，其中位于 17p的 p53基因的突變與 CLL的病程及轉歸密切相關。本研究對CLL患者的p53基因突變情況進行了觀察。現將結果報告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 收集2004年10月～2012年1月在南京醫科大學第一附屬醫院和南京醫科大學附屬淮安第一醫院初診的CLL患者80例，男53例，女27例;年齡31～86歲，中位年齡65歲;符合張之南主編的《血液病診斷及療效標準》中的CLL診斷標準［2］。Binet分期［3］A 期 54 例，B 期 6 例，C 期 20例。隨機選擇南京醫科大學第一附屬醫院體檢中心各項指標檢查均正常的健康體檢者10例作為對照。

1.2 p53基因檢測方法 取兩組外周血標本5 mL，EDTA抗凝，淋巴細胞分離液分離單個核細胞(MNC)，應用DNA提取試劑盒(挪威Dynal公司)提取DNA，置于－20℃保存備用。p53基因有11個外顯子(exon)，其中exon 1不編碼。起始密碼子位于exon 2，終止密碼子位于exon 11。針對p53基因exon 2～11用Primer Premier 5引物設計軟件設計引物。因exon 2和exon 3之間的內含子序列較短，故設計引物時將上游引物置于exon 2的上游，下游引物置于exon 3的下游，同時擴增exon 2和exon 3，依此類推，exon 5和 exon 6、exon 8和 exon 9亦同時擴增。p53基因11個exon的引物序列及產物長度，由上海英駿生物技術有限公司設計合成，見表1。PCR反應體系:DNA 25 ng，10 mmol/L的上、下游引物各1 μL，Master Mix(北京天根科技有限公司)12.5 μL，加去離子水至終體積 25 μL。exon 10擴增循環參數:94℃預變性7 min，94℃變性30 s，55℃退火45 s，72℃延伸45 s，共35個循環，72℃延伸10 min，4℃保存;其余外顯子退火溫度為60℃，其他循環參數相同。從每個反應中取5 μL PCR產物加樣于1.5%的含溴化乙錠的瓊脂糖凝膠，在0.5×TBE緩沖液中，90 V電泳30 min;陽性條帶回收、純化，由上海英駿生物技術有限公司測序，測序結果與野生型p53基因序列比對(野生型序列見http://p53.iarc.fr/TP53sequenceX54156.html)，判斷p53基因突變情況。

1.3 治療及療效評價方法 本組中25例應用FC方案(氟達拉濱25 mg/m2，環磷酰胺250 mg/m2，第1～3天靜滴)化療，28d為1個療程，應用2～6個療程。療效評價依據美國國家癌癥研究所(NCI)工作組推薦的標準。完全緩解(CR):癥狀消失，無淋巴結、肝、脾等臟器腫大，血象正常，包括中性粒細胞＞1.5×109/L、淋巴細胞 ＜4 ×109/L、血紅蛋白 ＞110 g/L、血小板＞100×109/L，骨髓涂片淋巴細胞＜30%。上述改善需維持2個月。部分緩解(PR):腫大的淋巴結、肝、脾縮小≥50%;下列幾項中至少滿足1項:中性粒細胞 ＞1.5×109/L，血紅蛋白 ＞110g/L、血小板＞100×109/L，無輸血情況下中性粒細胞、血紅蛋白、血小板數較治療前上升50%。上述狀癥改善持續2個月。總反應率(OR)為CR、PR例數之和占總例數的百分比。

表1 p53基因11個exon的PCR引物序列及產物長度

1.4 統計學方法 采用SPSS13.0統計軟件。計數資料比較行χ2檢驗及 Fisher's確切概率法。P≤0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 p53基因突變情況 80例CLL患者中12例(15.0%)檢測到p53基因突變，其中11例為錯義突變、1例為無義突變，未檢測到插入和缺失;突變位點均發生在exon 5～9，其中發生在exon 5 2例、exon 6 3例、exon 7 1例、exon 8 5例、exon 9 1例，exon 2～4、exon 10、exon 11未檢測到突變。健康體檢者外周血中均未檢測到p53基因突變。二者p53基因突變率比較，P ＜0.05。

2.2 p53基因突變與CLL臨床病理參數的關系 p53基因突變與CLL患者外周血白細胞計數、淋巴細胞計數、血紅蛋白水平和血小板計數均無關(P均＞0.05)，與 Binet分期、p53 基因缺失、IgVH 突變有關(P均＜0.05)。見表2。

表2 p53基因突變與CLL臨床病理參數的關系

2.3 p53基因突變CLL患者的FC方案化療效果本組80例患者中25例行FC方案化療，結果CR 5例，PR 11例，OR為64.0%。p53基因突變者(7例)，無1例達CR，PR 1例，OR 為14.3%;p53基因無突變者(18例)CR 5例，PR 10例，OR為83.3%。二者 OR 比較，P ＜0.05。

3 討論

在人類腫瘤中，p53基因的改變是迄今為止發現的變化頻率最高的一種分子異常，涉及一半以上的腫瘤［5］。p53基因是一種抑癌基因，定位于人類染色體17p13.1，編碼的蛋白質為53 kD。野生型p53作為一種轉錄因子，可以激活p21基因的轉錄及表達，而p21蛋白可抑制人周期素依賴性激酶(CDK)的活性，從而阻斷細胞周期的進程;p53蛋白亦可通過上調noxa、puma和bax等促凋亡基因，以及下調bcl-2和mcl-1等抗凋亡基因誘導細胞凋亡［6］。

突變的p53蛋白喪失了野生型p53蛋白的功能，同時其表達水平增高、半衰期延長，與野生型p53蛋白形成異源寡聚體使之失活，導致細胞惡性增殖及耐藥［7］。已發現，p53基因exon 5～8是突變熱點區域，不同組織器官腫瘤的p53突變譜有差異，但約有90%的突變集中在此區域［8］。p53基因突變在CLL并不常見，見于10% ～15%的初治CLL患者［9，10］。本研究中80例 CLL中12例存在 p53突變，突變率為15%，與國外報道類似［9，10］。其中 11例突變位點均位于突變熱點區域exon 5～8，1例位于exon 9，其他外顯子未檢測到突變。

研究［11］表明，p53突變與CLL臨床分期關系密切。Sturm等［10］發現，p53的突變率與患者初診時的年齡、性別、外周血白細胞計數等無關。本研究發現，p53突變與CLL患者外周血白細胞計數、外周血淋巴細胞計數、血紅蛋白水平和血小板計數均無關(P 均 ＞0.05)，而與 Binet分期有關(P ＜0.05)，表明p53突變患者往往處于病程晚期，預后差。

p53基因缺失與突變存在相關性，缺失往往伴隨另一條等位基因的突變。Saddler等［12］檢測了106例CLL患者p53基因的缺失和突變情況，15例p53缺失者中12例(80.0%)同時有p53突變，而91例無p53缺失者僅4例(4.4%)伴突變(P＜0.05)，表明p53基因缺失往往與突變伴隨。一個p53等位基因的缺失導致其表達產物mRNA和蛋白水平下降，即單倍不足［13］;若另一個等位基因亦發生突變則產生了突變的p53蛋白，失去了抑制腫瘤增殖的作用;同時，突變的p53蛋白與野生型p53蛋白相結合，抑制其功能，使得一些癌基因轉錄失控導致腫瘤的發生［7］。本研究結果顯示，12例突變者中5例伴有p53基因缺失，68例無突變者中僅4例伴有p53基因缺失，表明p53突變和缺失往往同時存在，兩者的共同作用可能導致腫瘤的發生。

Zenz等［14］研究發現，p53缺失伴突變、單獨缺失和單獨突變患者的生存期分別為 7.6、5.4、5.5 個月，均明顯短于無p53異常者的69個月。p53突變和缺失均為CLL的獨立預后因素，無論是p53缺失伴突變、單獨缺失還是單獨突變，患者的預后都很差。由于本研究中p53異常患者例數較少，且隨訪時間較短(中位隨訪24個月)，目前僅1例死亡，因而未能進行生存分析。

IgVH基因突變被認為是CLL最可靠的預后因素，無突變者預后較差［15］。已有研究［9］證實，p53突變與IgVH無突變有明顯相關性，p53突變者往往不伴隨IgVH突變，該類患者生存期短。我們亦發現，p53突變者中IgVH無突變率明顯高于p53無突變者(P ＜0.05)。

研究表明，p53突變的CLL患者對化療耐藥，且是有選擇的對烷化劑以及嘌呤類似物耐藥，提示烷化劑和嘌呤類似物通過p53途徑發揮作用［10］。對于p53突變者，應選用其他不涉及p53信號傳導系統的藥物，如大劑量甲強龍［16］、阿侖單抗［17］等。本研究發現，p53突變的CLL患者采用FC方案化療OR明顯低于無突變者。因此，對于p53突變的CLL患者，應避免選擇涉及p53信號傳導系統的藥物如環磷酰胺、氟達拉濱等。

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