STAT3反義寡核苷酸對人宮頸癌HeLa細胞定植和侵襲的影響

孫兆翎，韓 萍，吳維光，唐雅娟

(河北聯合大學附屬醫院，河北唐山063000)

反義寡核苷酸(ASODN)因技術簡單、低毒副作用和高特異性，現已廣泛應用于各種腫瘤相關基因沉默的實驗研究［1］。宮頸癌是婦科常見的惡性腫瘤，李曉蕾等［2］研究證明宮頸癌組織中信號轉導與轉錄激活因子3(STAT3)異常升高，并與病理分級、臨床分期及淋巴結轉移有關。已確認STAT3在多種腫瘤的細胞中表達升高，與腫瘤細胞增殖、凋亡、血管生成、免疫逃避和侵襲轉移密切相關，運用各種方法抑制STAT3基因表達將促進腫瘤細胞凋亡［3］。我們于2011年3～12月進行本研究，利用STAT3 ASODN技術轉染人宮頸癌HeLa細胞，抑制STAT3蛋白表達，觀察其對HeLa細胞體外侵襲能力的影響，探討STAT3信號通路在宮頸癌侵襲轉移中的作用

1 材料與方法

1.1 材料 人宮頸癌細胞株HeLa購于武漢典型生物保藏中心，胎牛血清購于杭州四季青公司，RPMI 1640培養液購于Gibco公司，Lipofectimane 2000脂質體轉染試劑盒購于Invitrogen公司，STAT3單克隆抗體購于Santa Cruz公司，辣根過氧化物酶標記的兔抗鼠二抗購于Rockland公司。轉染細胞的寡核苷酸由上海博亞生物工程有限公司合成，為全硫代修飾。

1.2 STAT3寡核苷酸設計和轉染 STAT3寡核苷酸序列參考文獻［4］，反義序列:5'-GCTCCAGCATCTGCTGCTTC-3'，正義序列:5'-GAAGCAGCAGATGCTGGAGC-3'。HeLa細胞常規培養于含100 mg/L胎牛血清的RPMI 1640培養液中，37℃、50 mL/L CO2培養箱培養，2.5 g/L胰酶消化傳代。將處于對數生長期的細胞接種于6孔板中，當細胞生長密度達50%時轉染STAT3寡核苷酸，操作按試劑盒說明書進行。轉染48 h后進行實驗。

1.3 RT-PCR檢測STAT3 mRNA表達 TRIzol提取細胞總RNA，逆轉錄合成cDNA，并作為模板進行PCR擴增，GAPDH為內參照。STAT3引物序列為:上游 5'-CCATACCTGAAGACAAGTTTATC-3'，下游5'-TGGAAATAATGGTGAAGGTGCTG-3'，擴增片斷為125 bp。GAPDH引物序列為:上游5'-CATCTTCTTTTGCGTCGCCA-3'，下游 5'-TCGCCCCACTTGATTTTGG-3'，擴增片斷為315 bp。PCR反應條件為:95℃預變性3 min，95℃ 30 s、52℃ 45 s、72℃1 min 35個循環后再72℃延伸10 min。擴增產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳，掃描條帶，以特異擴增條帶與內參條帶光密度之比作半定量分析。

1.4 Western blot檢測STAT3蛋白表達 配制試劑，收集細胞，裂解緩沖液提取細胞蛋白，經Bradford法定量后進行SDS-PAGE電泳，將電泳后分離的蛋白電轉至硝酸纖維素膜上，麗春紅染色5 min，脫色，搖床上封閉1 h，加STAT3單克隆抗體(1∶400)，溫室孵育2 h，TBST洗3次，每次10 min。再加入HRP標記的二抗，室溫下反應2 h后，TBST洗膜，ECL發光壓片顯色，拍照分析圖像。

1.5 軟瓊脂克隆形成實驗檢測細胞定植能力 在6孔培養板中每孔加入1.4 mL的0.6%底層瓊脂糖，待底層瓊脂糖凝固。取對數生長期細胞，胰酶消化成單個細胞懸液并調整濃度為10 000個/mL。每孔再加入1 mL的0.3%上層瓊脂糖和100 μL單細胞懸液，待頂層瓊脂糖凝固后，放置37℃細胞培養箱中培養14 d，倒置顯微鏡下計數軟瓊脂中細胞克隆數，實驗設3個平行孔。

1.6 體外侵襲實驗檢測細胞侵襲能力 取25 μL的Matrigel稀釋液加入Transwell板上室，覆蓋整個聚碳酯膜，待Matrigel聚合成膠。在Transwell板上室加入100 μL細胞懸液(5×105個/mL)和培養液200 μL。常規培養48 h后，用棉簽擦去Matrigel膜上未穿過的細胞，Gimsa染液染色，在高倍鏡下隨機取10個視野計數穿膜細胞，取平均數。此實驗重復3次。

2 結果

2.1 STAT3基因mRNA檢測結果 HeLa組、HeLaSTAT3-SODN組、HeLaSTAT3-ASODN組STAT3基因mRNA檢測結果分別為、0.64±0.09、0.66±0.11、0.39± 0.10，組間比較P＜0.05。其中HeLaSTAT3-ASODN組與HeLa組和HeLaSTAT3-SODN組比較 STAT3基因 mRNA表達均明顯降低(P＜0.05)，而 HeLa組與HeLaSTAT3-SODN組比較差異無統計學意義(P＞0.05)。見圖1。

圖1 細胞STAT3 mRNA PCR檢測圖

2.2 STAT3基因蛋白檢測結果 HeLaSTAT3-ASODN組、HeLaSTAT3-SODN組、HeLa組細胞 STAT3蛋白分別為0.39±0.13、0.68±0.14、0.68±0.11，組間比較P＜0.05。其中HeLa組與HeLaSTAT3-SODN組STAT3基因蛋白表達比較無統計學意義(P＞0.05)，但HeLaSTAT3-SODN組、HeLa組STAT3基因蛋白表達量均高于HeLaSTAT3-ASODN組(P＜0.05)。見圖2。

圖2 細胞STAT3蛋白Western印跡結果

2.3 軟瓊脂中細胞集落數檢測結果 HeLa組、HeLaSTAT3-SODN組、HeLaSTAT3-ASODN組的細胞集落數分別為(74.31±7.62)、(71.57±6.92)和(45.18± 7.69)個，前兩組細胞集落個數明顯高于HeLaSTAT3-ASODN組(P 均 ＜0.05)，而 HeLa組與HeLaSTAT3-SODN組之間無明顯差異(P＞0.05)。

2.4 穿透Matrigel膜的細胞數檢測結果 穿透Matrigel膜的細胞數 HeLa組(44.85±6.26)個、HeLaSTAT3-SODN組(45.46±6.79)個和 HeLaSTAT3-ASODN組(22.41±5.98)個，組間比較 P＜0.05。HeLaSTAT3-ASODN組穿透Matrigel膜的細胞數量比前兩組均明顯減少(P＜0.05)，而 HeLa組與HeLaSTAT3-SODN組之間無明顯差異(P＞0.05)。見封3圖14。

3 討論

STAT3 ASODN是人工合成的，可與STAT3 mRNA特定區域結合約20個堿基的DNA或RNA片段，阻止STAT3 mRNA翻譯。ASODN目前研究較為成熟，從ASODN片段的設計、轉染載體的選擇，到轉染細胞中 ASODN的濃度均有良好的可控性。Jing等［5］設計的四聯體寡核苷酸，現已證實能明顯抑制STAT3基因的激活。本研究應用具有穩定抑制效果的硫代修飾的STAT3 ASODN轉染人宮頸癌HeLa細胞，為觀察和評價STAT3基因對宮頸癌He-La細胞侵襲和定植能力的影響提供基礎實驗數據。

實驗結果顯示，本次實驗參照設計的STAT3 ASODN能有效抑制 HeLa細胞中 STAT3基因的mRNA及蛋白水平，在轉染有STAT3 ASODN的He-La細胞軟瓊脂中克隆細胞集落數也明顯少于前兩組，與Sun等［6］在抑制STAT3基因表達對前列腺癌細胞軟瓊脂克隆實驗的影響結論相吻合。充分證實STAT3基因與細胞定植能力密切相關，抑制STAT3基因異常表達，將明顯抑制腫瘤細胞的定植能力。其機制可能是作為信號轉導通路中的重要因子STAT3與多條轉導通路相關聯，即可被多種因子激活，又調控下游多種基因表達，其被異常激活后直接調控下游基因，促進腫瘤的發生及發展［7］。文獻報道與腫瘤增殖、凋亡、侵襲及轉移相關的，并受STAT3基因調控的基因有VEGF、cyclinD1、c-myc、Survivin、Bcl-xl、Mcl-1、MMPs等［8］。這些下游基因調控腫瘤組織新生血管形成，腫瘤細胞增強免疫耐受，逃避機體的免疫監視作用，控制細胞周期，抑制其凋亡，提高細胞生存活力，從而增強腫瘤細胞的定植能力。STAT3基因如同這些下游基因的總的閘門，抑制其在腫瘤細胞中異常表達，通過直接下調VEGF、cyclinD1、c-myc、Survivin等，上調Bcl-xl、Mcl-1等基因表達，從而抑制腫瘤細胞增殖、促進凋亡、減弱定植能力。顯而易見，對STAT3基因的影響將成為抑制細胞定植能力的關鍵點。

在細胞侵襲實驗中，HeLaSTAT3-SODN組及HeLa組穿透Matrigel膜的細胞數遠高于 HeLaSTAT3-ASODN組，此結果為STAT3基因與HeLa細胞侵襲能力相關提供了有力證據。抑制STAT3基因能有效抑制腫瘤細胞的浸潤及遠端轉移［9］。惡性腫瘤通過自身分泌并釋放蛋白水解酶，降解基質膜和細胞外基質，使腫瘤細胞侵入外基質及血管內，從而實現局部浸潤及遠端轉移。在此過程中，MMPs及VEGF發揮重要作用，有文獻報道MMPs與VEGF是STAT3的下游基因，直接受STAT3調控［10］。Silver等［11］研究表明，STAT3與癌細胞間相互粘連，與血管壁黏附密切相關。發揮重要作用的細胞黏附分子主要是通過酪氨酸磷酸化蛋白和局部黏著斑激酶起作用。阻斷STAT3基因功能將直接調控下游MMPs、VEGF基因表達，從而抑制腫瘤細胞的侵襲轉移能力。

本研究發現STAT3 ASODN能有效抑制HeLa細胞的定植和侵襲能力，為控制宮頸癌浸潤及轉移提供新的靶點。

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