HIWI在食管癌細胞系Eca-109中的表達及意義

劉志良，石磊芝，杜亞明*

(1遼寧醫學院附屬第一醫院，遼寧錦州121000;2浙江醫院)

食管癌是人類六大常見的惡性腫瘤之一，也是危害我國的主要惡性腫瘤之一，主要以食管癌鱗癌為主。治療主要是以手術為主的綜合治療，雖然我們手術對淋巴結清掃力度加大，但是5年生存率仍然不高。為了尋找更合理有效的治療方法，我們需要對食管癌做進一步的研究。近幾年，腫瘤干細胞(CSCs)學說認為CSCs是腫瘤的生長、轉移、耐藥等的根源［1］。HIWI基因是重要的干細胞標記物之一，在食管癌組織中已經發現其表達，表達水平與腫瘤的侵潤深度、組織學分級及預后有密切的關系［2］。2011年6月～2012年1月，本研究旨在應用RNA干擾(RNAi)技術降低食管癌細胞系中HIWI的表達，觀察其對細胞增殖的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 細胞:食管癌細胞系Eca-109購自上海中科院細胞庫。主要試劑:山羊抗人HIWI多克隆抗體(Santa Cruz公司);二抗:免疫熒光所用兔抗山羊IgG-TRITC TRITC-goat Anti-Mouse IgG，購自武漢博士德公司;胎牛血清(天津灝洋公司)，RPMI 1640培養基、胰酶(Gibco公司)。HIWI siRNA由上海吉瑪公司合成，正義鏈:5'-GUGGGCCUUAUAUCAGUAUTT-3';反義鏈:5'-AUACUGAUAUAAGGCCCACTT-3'。HIWI上游引物:5'-AGAGGTTACCAGA CCAGAATGG-3'，下游引物:5'-GTGTGGGAGAAACACTACCACTT-3'，77 bp;GADPH上游引物:5'-CCACCCATGGCAAATTCCCATGGCA-3'，下游引物: 5'-TCTAGACGGCAGGTCAGGTCCACC-3'，597 bp。引物、RT-PCR試劑盒(Takara公司);siRNA轉染培養基、LipofectamineTM2000及TRIzol均購自Invitrogen公司;瓊脂糖(西班牙Biowest)。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 食管癌細胞系Eca-109培養于RPMI 1640培養基中(調整濃度:1.5 g/L碳酸氫鈉、4.5 g/L葡萄糖、1.0 mmol/L丙酮酸鈉、10 mmol/L HEPES)，培養基含有10%胎牛血清，不含抗生素，細胞于5%CO2、37℃的細胞培養箱中培養;細胞生長至80%融合時進行傳代。

1.2.2 細胞免疫熒光 用胰酶消化細胞后吹打均勻，每孔約4 000個細胞接種在24孔板上，5%CO2孵箱培養過夜;4%多聚甲醛固定10 min;Triton X-100作用15 min;5%BSA室溫封閉1 h;一抗濕盒4℃孵育過夜;二抗室溫避光孵育2 h;Herst室溫避光復染15 min。除用5%BSA封閉以后不用PBS清洗以外，其余步驟后面都用PBS洗3次，每次3 min;熒光照相，200倍鏡下觀察。

1.2.3 RNAi 轉染前1 d，取對數生長期的食管癌細胞，按4×105個/孔接種于6孔板。5%CO2、37℃的細胞培養箱中培養過夜，細胞融合度達50%～ 80%時，應用LipofectamineTM2000進行轉染，按產品使用手冊進行轉染，每孔100 pmol siRNA、5 μL LipofectamineTM2000，其培養液終體積為2 mL。細胞在5%CO2、37℃條件下培養6 h后，將培養基更換為完全培養基。無義siRNA作為陰性對照，單純LipofectamineTM2000作為空白對照。轉染后24、48、72和96 h分別收集細胞，RT-PCR檢測HIWI基因mRNA的表達水平變化。

1.2.4 RT-PCR 用TRIzol提取細胞總RNA后取5 μg按照RT-PCR試劑盒說明書進行逆轉錄合成cDNA，PCR擴增目的基因時采用25 μL體系，94℃變性5 min，94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s，共35個循環，最后72℃ 10 min，4℃保存。2.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增結果，Gel-pro Analyzer軟件進行半定量分析。

1.2.5 細胞增殖變化 為觀察HIWI低表達后是否影響食管癌細胞的增殖，在96孔板中每孔接種6 000個細胞，應用脂質體LipofectamineTM2000作為轉染試劑進行轉染，以無義siRNA為陰性對照，單純的脂質體為空白對照，轉染的濃度為25 nmol/L。在轉染24、48、72和96 h后應用MTT法檢測細胞活力，畫出細胞生存曲線，觀察降低HIWI轉錄后對細胞增殖的影響，實驗重復3次，結果一致。

1.2.6 統計學方法 應用SPSS13.0軟件進行統計分析，不同組之間的均數比較采用單因素方差分析及兩兩比較分析用SNK檢驗，以P≤0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 HIWI蛋白在食管癌細胞系Eca-109中的表達情況 HIWI陽性反應所發出的紅色熒光主要集中在細胞核，部分表達在細胞質，少量陰性表達，細胞之間表達存在差異，見插頁Ⅲ圖11。

2.2 HIWI特異的 siRNA能降低食管癌細胞系Eca-109中HIWI轉錄 通過RT-PCR檢測發現，轉染HIWI特異siRNA組24、48、72、96 h后HIWI的表達均降低，其中48 h時結果最明顯(圖1)，結果分析最高抑制率能達到80%以上。

2.3 HIWI特異的siRNA降低HIWI在食管癌細胞系Eca-109中的表達后對細胞增殖的影響 MTT檢測發現HIWI特異siRNA組細胞比對照組細胞增殖速度減慢，差異有統計學意義，而3個對照組之間差異無統計學意義。可見HIWI轉錄降低后食管癌細胞增殖速度減慢，見圖2。

3 討論

圖1 HIWI siRNA對Eca-109細胞HIWI mRNA表達的影響注:1為只有脂質體的空白對照組，2為無義siRNA陰性對照組，3為HIWI特異siRNA組

圖2 HIWI轉錄降低后對Eca-109細胞增殖的影響注:M為只有脂質體的空白對照組，C為無義siRNA陰性對照組，N為無處理組，S為HIWI特異siRNA組

進一步研究食管癌的發病機制、開發新的治療手段或提高現有治療方法的效率是我們的當務之急。通過對CSCs學說的學習我們可以得到一個治療腫瘤的新思路，最近Lee等［3］也報道導致肝癌復發及產生化療抗藥性的元兇是一種癌干細胞，只要能夠抑制該干細胞，就可提升治療肝癌的效果，這一新研究發現可能為了解腫瘤形成和未來癌癥的治療帶來重大突破。

PIWI于1997年首先在果蠅的生殖干細胞內被發現［4］。PIWI家族在進化中高度保守，并且在維持干細胞的自我更新、分化增殖，配子的發生發育和增殖，以及RNAi和轉錄調控中都起著重要作用，是調節干細胞和生殖細胞的關鍵因子［5～7］。HIWI是PIWI于人類的同系物。SOX2、OCT4和HIWI三者皆為維持胚胎干細胞全能性調控網絡的重要轉錄因子，有人研究發現SOX2、OCT4和HIWI均在食管癌中高表達。而Wang等［8］已經發現SOX2和OCT4在食管癌中表達并影響食管鱗癌細胞的增殖、致瘤能力和耐藥性等。因此我們探討HIWI在食管癌細胞中的表達有重要意義。

我們通過細胞免疫熒光檢測到HIWI在食管癌細胞系Eca-109高表達，以核表達為主，少部分胞質表達，有很少細胞陰性表達。這與何煒報道HIWI在食管癌組織中胞質胞核均著色是一致的。HIWI是干細胞的重要轉錄因子之一，這說明看上去都一樣的食管癌細胞其實存在分化的不一致。因此我們推斷HIWI強陽性的細胞可能就是傳說中的食管癌干細胞。

既然HIWI在食管癌細胞系Eca-109中高表達，那么我們可以假設，像在胚胎干細胞中所報道的那樣，HIWI可能與食管癌的增殖有關。為了驗證我們的假設通過RNAi方法降低HIWI在食管癌細胞系中的表達，然后檢測HIWI低表達后食管癌細胞系Eca-109生長曲線的變化，看其是否能夠減慢食管癌細胞的增殖速度。實驗結果顯示HIWI特異siRNA組的細胞在48和72 h增殖速度明顯慢于3個對照組，說明HIWI對食管癌細胞增殖起重要作用。我們推測腫瘤就是由于各種原因提高了 HIWI、SOX2、OCT4和NANOG等干細胞轉錄因子的轉錄活性，使得腫瘤表現出來的增殖失控。通過降低這些基因的轉錄可以作為腫瘤治療的新手段。

綜上所述，通過本實驗研究我們發現HIWI在食管癌細胞系Eca-109中高表達，并且存在差異;通過RNAi技術降低HIWI的表達后能夠減慢食管癌細胞的增殖速度。本研究的結果是對CSCs學說的支持，也為食管癌的靶向治療提供基礎研究，為根治食管癌帶來新的希望。

［1］Reya T，Morrison SJ，Clarke MF，et al.Stem cells，cancer，and cancer stem cells［J］.Nature，2001，414(6859):105-111.

［2］He W，Wang Z，Wang Q，et al.Expression of HIWI in human esophageal squamous cell carcinoma is significantly associated with poorer prognosis［J］.BMC Cancer，2009，9:426.

［3］Lee TK，Castilho A，Cheung VC，et al.CD24(+)liver tumor-initiating cells drive self-renewal and tumor initiation through STAT3-mediated NANOG regulation［J］.Cell Stem Cell，2011，9(1): 50-63.

［4］Lin H，Spradling AC.A novel group of pumilio mutations affects the asymmetric division of germline stem cells in the Drosophila ovary［J］.Development，1997，124(12):2463-2476.

［5］Hutvagner G，Simard MJ.Argonaute proteins:key players in RNA silencing［J］.Nat Rev Mol Cell Biol，2008，9(1):22-32.

［6］Liu X，Sun Y，Guo J，et al.Expression of hiwi gene in human gastric cancer was associated with proliferation of cancer cells［J］.Int J Cancer，2006，118(8):1922-1929.

［7］Seto AG，Kingston RE，Lau NC.The coming of age for Piwi proteins［J］.Mol Cell，2007，26(5):603-609.

［8］Wang Q，He W，Lu C，et al.Oct3/4 and Sox2 are significantly associated with an unfavorable clinical outcome in human esophageal squamous cell carcinoma［J］.Anticancer Res，2009，29(4):1233-1241.