芪藶強心膠囊對心力衰竭大鼠心室重構的作用及機制研究

徐 濤，李方江，陳立鋒，李會賢

(1河北北方學院附屬第一醫院，河北張家口075000;2河北北方學院基礎醫學院)

慢性心力衰竭(簡稱心衰)發生發展的基本機制是心室重構，基質金屬蛋白酶(MMPs)是一組能特異降解細胞外基質成分的鋅依賴性酶家族，在心室重構中起重要作用［1］。我們于2009年12月～2011年2月進行本實驗，采用腹主動脈結扎致大鼠心衰模型，觀察芪藶強心膠囊對心衰大鼠心室重構及MMPs表達的影響，探討芪藶強心膠囊治療心衰大鼠的分子機制，為其臨床應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 動物 健康SD大鼠，清潔級，雌雄各半，體質量200～240 g，購于河北省動物實驗中心，動物許可證號:SCXK(冀)2008-1-003。

1.2 藥物 芪藶強心膠囊，由石家莊以嶺藥業股份有限公司提供。

1.3 主要試劑與儀器 內皮素-1(ET-1)、血管緊張素Ⅱ(Ang-Ⅱ)和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)放射免疫試劑盒購于北京普爾偉業生物科技有限公司;所用一抗購自Santa Cruz;RT-PCR試劑盒購自大連寶生物技術公司;MMP-2、MMP-9及基質金屬蛋白酶抑制因子1(TIMP-1)引物由上海生工生物技術公司合成。

1.4 動物分組與造模 大鼠隨機分為5組:假手術組(S)，模型組(M)，芪藶強心膠囊高、中、低劑量組［1.2、0.6、0.3 g/(kg·d)，QLQXH、QLQXM、QLQXL］。每組12只。藥物以蒸餾水稀釋至所需濃度，給藥體積均為10 mL/kg，給藥途徑為灌胃給藥。

采用腹主動脈縮窄法制作心衰大鼠模型［2］。大鼠用戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，劍突下腹正中切口，分層打開腹腔，在腎動脈分支以上鈍性游離腹主動脈，將7號注射器針頭平行置于腹主動脈上，用4號手術絲線將腹主動脈和注射器一同結扎，然后緩慢將注射器撤出，關腹，分層縫合。使大鼠腹主動脈直徑縮窄為0.7 mm。假手術組開腹后將手術絲線穿過腹主動脈，除不縮窄腹主動脈外，其他操作與模型組完全相同。術后4周開始灌胃給藥，1次/d，連續給藥8周。

1.5 觀察指標及方法

1.5.1 血流動力學指標的測定［3］實驗結束前麻醉大鼠，分離右頸總動脈，以0.3%肝素生理鹽水充盈插管，連接BL-420F型生物醫學信號采集處理系統，將插管逆行進入左心室后記錄其左心室壓峰值(LVP)、左室舒張末期壓(LVEDP)、左室內壓最大上升速率(+LVdp/dtmax)、左室內壓最大下降速率(－LVdp/dtmax)及平均動脈壓(MAP)和心率(HR)。

1.5.2 ET-1、Ang-Ⅱ和TNF-α檢測 頸總動脈放血處死大鼠，采用放射免疫分析方法測定血漿中ET-1、Ang-Ⅱ和TNF-α，操作按說明書進行。

1.5.3 左心室指數測定 稱取左心室實際重量，并與體質量相除，得到左心室指數。

1.5.4 RT-PCR方法測定MMP-2、MMP-9及TIMP-1的mRNA表達 取大鼠心肌組織，常規方法提取RNA，按RT-PCR試劑盒要求進行反轉錄反應和PCR擴增目的片段，引物序列如下:MMP-2:上游5'-TGGACCCTGAAACCGTGGAT-3'，下游5'-CTGTATTCCCGACCGTTGAAC-3'，擴增產物長度330 bp; MMP-9:上游5'-ACCTCCAACCTCACGGACA-3'，下游5'-ACCACAACTCGTCGTCGTC-3'，擴增產物長度525 bp;TIMP-1:上游 5'-CATCCTCTTGTTGCTATCACTGA-3'，下游 5'-CTGCGGTTCTGGGACTTGT-3'，擴增產物長度279 bp;內參照β-actin:上游5'-CAGGGTGTGATGGTGGG-3'，下游 5'-GGAAGAGGATGCGGCAG-3'，擴增產物長度500 bp。PCR反應條件為96℃ 4 min預變性，95℃ 30 s、58℃ 40 s、72℃ 30 s 25個循環，72℃延伸10 min。PCR擴增產物用1%瓊脂糖凝膠電泳分離，掃描成像，用凝膠成像分析系統進行密度分析。以β-actin作為內參照。用各目的基因片段密度值/內參照密度值的比值進行比較。

1.5.5 明膠酶譜法測定MMPs活性 制備8% SDS-PAGE分離膠(含0.2%明膠)，上覆4%的濃縮膠，取20 μL處理后的標本上樣，40 mA恒流電泳，溫度＜4℃。電泳后凝膠置于洗脫液中振蕩洗脫2次，45 min/次;置漂洗液漂洗2次，20 min/次;置于孵育液中37℃孵育18 h。經染色液染色3 h，用脫色液脫色后，MMPs顯示為位于藍色背景上的透亮帶。凝膠經凝膠掃描儀掃描。

2 結果

2.1 血流動力學結果 見表1。

2.2 心室指數、ET-1、Ang-Ⅱ和TNF-α檢測結果見表2。

表1 芪藶強心膠囊對心衰大鼠血流動力學的影響(±s，n=12)

表1 芪藶強心膠囊對心衰大鼠血流動力學的影響(±s，n=12)

注:與S組比較，#P＜0.05，▲P＜0.01;與M組比較，*P＜0.05，△P＜0.01

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表2 芪藶強心膠囊對心衰大鼠心室指數、ET-1、Ang-Ⅱ和TNF-α的影響(±s，n=12)

表2 芪藶強心膠囊對心衰大鼠心室指數、ET-1、Ang-Ⅱ和TNF-α的影響(±s，n=12)

注:與S組比較，#P＜0.01;與M組比較，*P＜0.05，△P＜0.01

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2.3 MMP-2、MMP-9、及TIMP-1檢測結果 見表3。

表3 芪藶強心膠囊對心衰大鼠MMP-2、MMP-9及TIMP-1 mRNA表達的影響(±s，n=5)

表3 芪藶強心膠囊對心衰大鼠MMP-2、MMP-9及TIMP-1 mRNA表達的影響(±s，n=5)

注:與S組比較，△P＜0.01;與M組比較，*P＜0.01

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2.4 MMPs活性 與S組比較，M組MMP-2、MMP-9活性均顯著增加，與M組比較，芪藶強心組MMP-2、MMP-9活性均顯著下降。見圖1。

圖1 各組大鼠MMPs活性明膠酶譜圖

3 討論

慢性心衰發生發展的根本機制是神經內分泌長期激活導致的心室重構［3］，建立腹主動脈縮窄術造成后負荷過重的心衰模型對于研究心肌肥厚演變、心室重構具有重要價值。本實驗結果表明模型組大鼠與假手術組比較，血流動力學指標LVP、LVEDP、+LVdp/dtmax明顯上升，MAP、HE明顯降低，提示大鼠心功能障礙，心衰模型建立成功。實驗結果還表明，芪藶強心膠囊能改善心衰大鼠的血流動力學，同時能夠顯著降低大鼠血漿中ET-1、Ang-Ⅱ和TNF-α的含量，而這些因子是心室重構的關鍵因素。Ang-Ⅱ與其受體結合后，引起細胞異常增殖、體積增大，導致心肌肥厚，降低心臟順應性，增加僵硬度，形成心室重構;ET-1可以直接引起分子和細胞變化而導致心肌肥厚，又能刺激Ang-Ⅰ轉變為Ang-Ⅱ，致使增強的Ang-Ⅱ引起醛固酮分泌而影響心室重構; TNF-α可引起心肌細胞數目減少，同時使心臟中膠原含量增加，促進心室重構［5，6］。因此認為芪藶強心膠囊能夠改善心衰大鼠的心功能，抑制心室重構，延緩心衰的發生。

MMPs家族是一個內源性鋅依賴酶家族，可降解除多糖以外所有細胞外基質成分［7］。研究發現慢性心衰時各種刺激因素導致MMPs活性升高，而TIMPs活性降低，MMPs/TIMPs平衡失調，正常的膠原蛋白被升高的MMPs降解并被缺乏連接結構的纖維性間質所取代，心臟纖維膠原網絡被破壞，最終導致左室擴張及球型變［8］。MMP-2、MMP-9作為MMPs家族分布最廣的兩種亞型，參與了多種心臟疾病的病理過程，本實驗結果亦顯示心衰大鼠模型組MMP-2、MMP-9、TIMP-1表達均顯著增加，明膠酶譜法結果觀察到MMP-2、MMP-9活性均顯著增加，而給予芪藶強心膠囊治療組的大鼠MMP-2、MMP-9表達降低，TIMP-1表達升高，MMP-2、MMP-9活性降低，提示芪藶強心膠囊能抑制 MMPs活性，調節MMPs/TIMPs平衡，改善心室重構。

綜上所述，芪藶強心膠囊可通過抑制MMPs活性、調節MMPs/TIMPs平衡改善心衰大鼠的心功能，抑制心室重構，延緩心衰的發生。

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