絲裂霉素C對增生性瘢痕成纖維細胞增殖的影響

吳曉明，孫 奎，張紅霞，許新華，孫喜平，楊景哲

(承德醫學院附屬醫院，河北承德067000)

增生性瘢痕是皮膚損傷后成纖維細胞(FB)增殖的結果，FB是合成、分泌大量膠原蛋白及其他細胞外基質，而且是多種生長因子的產生者，它的過度增生及功能的亢進是病理性瘢痕發生、發展的基礎。在增生性瘢痕組織中及體外培養的增生性瘢痕FB中均發現了細胞增殖調控及細胞程序性死亡方面的異常。2010年1～12月，本研究旨在探討絲裂霉素C(MMC)對增生性瘢痕FB增殖的影響及機制，為增生性瘢痕的治療提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 標本來源 選取承德醫學院附屬醫院燒傷整形外科手術治療的患者，增生性瘢痕患者無明顯創傷史，且增生性瘢痕都處于增生期，均經臨床和病理確診。10例瘢痕增生標本，其中男7例、女3例;部位分布:胸部6例，肩部2例，耳垂部1例，背部1例。

1.2 FB培養 將手術切下的增生性瘢痕組織采用組織塊貼壁培養法進行體外培養。在無菌條件下切除表皮及皮下脂肪，將標本制成1 mm3左右的組織塊，置于培養瓶中，在95%空氣、5%CO2、37℃、飽和濕度條件下培養8～12 h。然后加入適量含15%胎牛血清的DMEM培養液，繼續培養，3～4 d換液1次，2～3周后，原代細胞生長成單層，用0.25%胰蛋白酶消化后，按1∶3的比例傳代培養。

1.3 MTT法測定FB細胞的增殖 取對數生長期的增生性瘢痕FB，用2.5 g/L胰酶消化，調整細胞密度至2×104/mL，接種于3塊96孔培養板，每孔100 μL。常規培養FB 24 h后，吸去培養液和未貼壁細胞，更換含不同藥物濃度的培養液。實驗分組:正常對照組，用DMEM培養液;MMC干預組，終末濃度分別為2.5、12.5、50、100、200 μg/mL。每孔加入各組溶液200 μL，每濃度復種8孔。標準環境下分別各孵育24、48、72 h后，向每孔內加入20 μL MTT(5 mg/mL)溶液，繼續培養4 h。倒置顯微鏡下觀察MTT結晶狀況，然后棄去孔內上清液，每孔內加入150 μL二甲基亞砜，搖床振蕩10 min后，在酶標儀下測定波長490 nm處的光密度值，設8個復孔，計算藥物作用于FB的生長抑制率。抑制率=1－(實驗藥物組 A490值/空白對照組 A490值)× 100%，最后以時間為X軸，抑制率為Y軸繪制生長曲線，并獲得最佳培養時間。

1.4 Western blot方法檢測Smad7蛋白表達水平將待收集的FB以預冷的PBS液洗2次，加入100 μL預冷裂解液，冰浴30 min，刮勺收集樣本，4℃12 000 r/min離心20 min，取上清，以考馬斯亮藍法測定提取蛋白濃度。取 15 μL蛋白質經 10% SDS2PAGE垂直凝膠電泳后，電轉移至PVDF膜上，用麗春紅染色觀察轉移效果，5%牛血清白蛋白室溫封閉1 h后，加入相應的1∶2 000稀釋的Smad7，4℃過夜，TBST洗膜后，加入1∶2 000辣根過氧化物酶標記的羊抗兔二抗，室溫作用1 h，TBST洗膜后，ECL增強發光，在暗室中將膜貼在X線膠片下曝光，常規方法顯影、定影，直至顯影出電泳帶。雜交信號在圖像分析系統中進行光密度分析。

1.5 統計學方法 采用SPSS11.5軟件進行統計處理，所有數據資料以±s表示，進行方差分析，兩兩比較用LSD-t檢驗，以P≤0.05為有統計學差異。

2 結果

2.1 增生性瘢痕FB細胞形態學觀察 原代培養體外增生性瘢痕FB呈典型的梭形，走向趨于一致，多呈平行排列，細胞中央有圓形或卵圓形核，核質比例高。見插頁Ⅱ圖8。約10 d后細胞可長滿培養瓶，進行傳代。傳代后的細胞生長速度較快，3～4 d即可再次傳代。

2.2 MMC對增生性瘢痕FB增殖活性的影響 見表1。由表1可見，2.5 μg/mL的MMC即對細胞生長有明顯的抑制作用，在200 μg/mL時達到最大，顯示出明顯的劑量—效應依賴關系。隨著培養時間的增加，細胞生長抑制率呈現上升趨勢，顯示出一定的時間—效應依賴關系。24 h為最佳作用時間。所用藥物作用于FB中在規定的時間、濃度內無細胞壞死。

2.3 Smad7蛋白表達結果 見圖1。Western blot檢測顯示，增生性瘢痕FB經不同濃度的MMC作用24 h后，Smad7蛋白表達量比正常對照組增多(P＜0.05)。并且隨著藥物濃度的增加，Smad7蛋白表達量有逐漸增高趨勢(P＜0.05)。

3 討論

增生性瘢痕是FB增生異常旺盛，細胞外基質中膠原、蛋白多糖、糖蛋白等過度沉積、膠原纖維排列紊亂的一種皮膚纖維化疾病。瘢痕過度增生的病因學仍尚未清楚。增生性瘢痕組織中FB生物學特性異常，數量增多，合成并分泌大量膠原纖維，被認為是增生性瘢痕組織形成的關鍵環節［1］。

表1 MMC對增生性瘢痕FB增殖活性的影響(±s，n=8)

表1 MMC對增生性瘢痕FB增殖活性的影響(±s，n=8)

注:與正常對照組比較，*P＜0.01;與同濃度24 h時比較，△P＜0.05，#P＜0.01

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圖1 各組FB中Smad7蛋白表達

MMC是一種抗腫瘤藥物，還是一種強有力的抑制FB增殖的藥物，在耳鼻喉科、眼科、神經外科等領域中治療瘢痕應用比較廣泛，但在治療瘢痕增生臨床及基礎研究較少。于冬梅等［2］實驗結果表明，MMC對體外培養瘢痕疙瘩FB增殖的抑制作用與藥物濃度、處理時間有關，同時發現低劑量MMC對瘢痕疙瘩FB的作用是通過下調cyclinD1抑制細胞增殖和激活caspase-3誘導細胞凋亡實現的。Kim等［3］以0.02%MMC處理FB，證明MMC誘導其凋亡是通過下調bcl mRNA，上調bax mRNA表達量，同時下調TGF-β1mRNA而實現的。劉鶯等［4］通過MTT檢測證實100 μg/mL MMC對KFB細胞的增殖抑制效果最佳(P＜0.01)，為該藥物臨床應用提供了有力的實驗依據。目前研究認為，MMC抑制FB增殖作用是氟尿嘧啶的100倍，并有時間依從性，作用時間可達到無限期抑制增生，同時與劑量密切相關，大劑量時可以是不可逆性抑制［5］。本實驗結果顯示，MMC對細胞生長有明顯的抑制作用，且呈劑量和時間依賴性。

TGF-β可促進FB增殖，增加膠原等細胞外基質的合成。TGF-β信號主要由Smad家族介導，其作為配體形成受體復合物，激活Smad，進入核，共同激活或抑制它們調節靶基因的轉錄［6］。Smad家族是TGF-β受體下游信號蛋白。TGF-β是通過正、負反饋的調節通路自我調控的，其中Smad2、3發揮正反饋作用，Smad7發揮負反饋作用。Ashcroft等［7］證實Smad3缺陷的小鼠上皮再生加快，瘢痕形成減少。Smad7表達增加，能夠阻斷FB內信號轉導，以抑制瘢痕增生。潘祝彬等［8］實驗結果表明5-氟尿嘧啶抑制瘢痕增生主要通過增加Ⅰ-Smad轉導信號Smad7的表達，抑制TGF-β的病理性作用，使FB增殖受阻而發揮作用。本實驗發現，MMC可通過增加抑制性Smad7蛋白的表達及使其從胞核轉移至胞質發揮作用，從而抑制FB增殖，進一步為臨床提供理論依據。

在目前缺乏更有效的抗瘢痕藥物的情況下，本研究為MMC在臨床上治療及預防增生性瘢痕提供了實驗基礎。今后的研究應著重于其作用機理和動物實驗，以期待早日將MMC應用于臨床。

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