丙型肝炎病毒非結(jié)構(gòu)蛋白4B對肝癌細胞增殖的影響

楊 春，陳 文，鐘曉琳，王忠瓊，陳 楓，夏紀毅

(瀘州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，四川瀘州64600)

HCV感染是全球流行疾病，與原發(fā)性肝癌(HCC)關(guān)系密切［1］。丙型肝炎非結(jié)構(gòu)蛋白 4B (HCV-NS4B)是HCV的一個非結(jié)構(gòu)蛋白，其功能到目前為止仍舊還不是很清楚［2］。相關(guān)研究顯示NS4B蛋白在HCV感染細胞的惡性變中起重要作用［3］。我們前期研究證實HCV-NS4B促進肝細胞增殖［4］，還發(fā)現(xiàn)HCV-NS4B可激活原癌基因如c-myc等在肝細胞的表達［5］，提示HCV-NS4B在丙型肝炎致癌機制中可能起一定作用。而關(guān)于HCVNS4B蛋白對肝癌細胞增殖的影響及其機制的研究國內(nèi)外未有報道。2010年2月～2011年3月，本研究采用HCV-NS4B表達載體，利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染技術(shù)將NS4B導(dǎo)入肝癌細胞，檢測其對肝癌細胞周期的影響，以及其對增殖細胞核抗原(PCNA)和周期素D1(cyclinD1)表達的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 人肝癌細胞株HepG2由瀘州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院中心實驗室提供，PCXN2-NS4B質(zhì)粒為李昌平教授構(gòu)建并保存。

1.2 實驗方法

1.2.1 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染及鑒定 HepG2細胞分為3組:空白對照組(未轉(zhuǎn)染的 HepG2細胞)，空白載體組(PCXN2轉(zhuǎn)染組)，PCXN2-NS4B轉(zhuǎn)染組，每組設(shè)3個復(fù)孔。對數(shù)生長期細胞轉(zhuǎn)染前1 d以2×105/mL接種于6孔板，37℃，5%CO2培養(yǎng);待細胞生長達60%～80%匯合，加入以1.5 μg/4 μg配制質(zhì)粒/脂質(zhì)體混合物(DOSPER脂質(zhì)體細胞轉(zhuǎn)染試劑盒購自德國Roche公司)，空白對照組加入等體積無血清培養(yǎng)基。24 h后加入800 mg/mL G418(購自上海Sangon公司)篩選，待空白對照組細胞全部死亡后，G418減量為200 mg/L維持篩選并傳代培養(yǎng)。

采用TRIzol試劑(購自美國Invitrogen公司)一步法提取HepG2細胞總RNA。使用NS4B特異性的反向引物進行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。以cDNA作為模板，加入GoTaq DNA多聚酶、NS4B特異性的引物進行PCR反應(yīng)。引物:正義鏈5'-CCGCTCGAGTTAGCATGGCGTGGAGCAGTCCT-3'，反 義 鏈 5'-CCGCTCGAGACCATGGCCTCACACCTCCCTTACAT-3'(RT-PCR試劑盒購自美國Sigma公司)。RT-PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定是否轉(zhuǎn)染成功。

1.2.2 MTT法繪制細胞生長曲線 轉(zhuǎn)染后HepG2細胞以胰蛋白酶消化，1×103/孔接種于96孔板，各接種5復(fù)孔，共接種7個板，以完全培養(yǎng)基作為空白調(diào)零孔，每天取1個96孔板檢測。待檢測板每孔加入MTT液(購自上海Sangon公司)5 mg/mL，20 μL于37℃，5%CO2培養(yǎng)4 h，每孔加入150 μL二甲基亞砜。490 nm波長測光密度值(OD值)，每個標本的OD值應(yīng)減去零孔的OD值。以時間為橫坐標，OD值為縱坐標，繪制生長曲線。

1.2.3 流式細胞儀測細胞周期 轉(zhuǎn)染后HepG2細胞以胰蛋白酶消化，2 000 r/min離心5 min，PBS重懸細胞2次，調(diào)節(jié)細胞濃度為(1～2)×105/mL，取1 mL置于流式上機管中檢測細胞周期。

1.2.4 PCNA、cyclinD1蛋白表達的檢測 免疫細胞化學(xué)方法檢測:轉(zhuǎn)染后HepG2細胞以胰蛋白酶充分消化。1×105傳代于預(yù)置玻片(經(jīng)多聚賴氨酸處理)的6孔板中，37℃、5%CO2培養(yǎng)24 h。固定沖洗細胞爬片，抗原修復(fù)，10%正常山羊血清封閉，再逐步滴加一抗、生物素標記二抗、鏈霉抗生物素蛋白—過氧化物酶溶液，最后經(jīng)DAB顯色，蘇木精復(fù)染，脫水、透明、封片、鏡檢。陰性對照除了用PBS代替一抗外，所有步驟同上。每組細胞各進行6次獨立性實驗。(鼠抗人PCNA單克隆抗體和鼠抗人cyclinD1單克隆抗體均購自美國SANTA CRUZ公司;DAB顯色劑購自美國Sigma公司)。

免疫細胞化學(xué)結(jié)果判定:陽性呈棕黃色顆粒定位于胞質(zhì)，采用OLYMPUS BX50生物顯微高清晰度彩色病理圖文采集系統(tǒng)進行圖像采集。Image-Pro Plus 6.0圖像分析系統(tǒng)自動測定免疫細胞化學(xué)陽性產(chǎn)物OD值。每張爬片在100倍視野下隨機測5個視野，取其均值。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 以SPSS12.0統(tǒng)計學(xué)軟件分析數(shù)據(jù)，計量資料以±s表示，多組間兩兩均數(shù)比較采用SNK法，以P≤0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 基因轉(zhuǎn)染及鑒定 PCXN2-NS4B組有HCVNS4B表達，表明基因轉(zhuǎn)染入HepG2細胞后，可穩(wěn)定表達NS4B，見圖1。

圖1 PCXN2-NS4B轉(zhuǎn)染組RT-PCR產(chǎn)物1%瓊脂糖電泳圖

2.2 NS4B對HepG2細胞生長曲線的影響 轉(zhuǎn)染PCXN2-NS4B后，HepG2細胞生長速度較空白載體組增快(圖2)。

圖2 HepG2細胞生長曲線

2.3 NS4B對肝細胞細胞周期的影響 見表1。

2.4 NS4B對PCNA、cyclinD1蛋白表達的影響 見表2，插頁Ⅱ圖6、7。

表1 HepG2細胞細胞周期情況(±s)

表1 HepG2細胞細胞周期情況(±s)

注:與空白載體組及空白對照組比較，*P＜0.05

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表2 PCNA及cyclinD1蛋白在HepG2細胞表達OD值(±s)

表2 PCNA及cyclinD1蛋白在HepG2細胞表達OD值(±s)

注:與空白載體組及空白對照組比較，*P＜0.05

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3 討論

細胞異常增殖是腫瘤發(fā)生的重要機制之一，腫瘤細胞的增殖率是決定腫瘤生物學(xué)行為的一個重要參數(shù)［6］。我們將外源性 HCV-NS4B基因?qū)際epG2細胞。流式細胞儀檢測細胞周期顯示，轉(zhuǎn)染NS4B的肝癌細胞進入靜止期的細胞減少，而S期和G2/M期顯著增多，表明肝癌細胞的增殖能力明顯增強，提示HCV-NS4B可能通過某種機制刺激細胞DNA合成，細胞進入S期，促進細胞增殖。HCVNS4B主要作用包括抑制翻譯，調(diào)節(jié)NS4B RNA依賴的RNA聚合酶的活性，引起細胞轉(zhuǎn)化，誘導(dǎo)細胞非折疊蛋白反應(yīng)等［7～9］。研究發(fā)現(xiàn)NS4B蛋白還能夠激活細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，影響細胞生長調(diào)節(jié)［10］。我們前期研究亦證實HCV-NS4B可通過增進細胞周期素cyclinD1、PCNA表達，干擾肝細胞周期，促進肝細胞增殖［4］。還發(fā)現(xiàn)HCV-NS4B可激活原癌基因如c-myc等在肝細胞的表達［5］。而本研究進一步提示HCV-NS4B對肝癌細胞亦有促進細胞增殖的作用。

細胞周期受多種蛋白調(diào)節(jié)。PCNA是DNA聚合酶δ的輔助蛋白，直接參與細胞增殖的DNA復(fù)制［11］。作為一個內(nèi)源性增殖細胞的標記物，與腫瘤的增長活性、轉(zhuǎn)移及預(yù)后有密切關(guān)系，PCNA陽性細胞的多少能反映腫瘤生長速度及惡性程度，預(yù)示腫瘤轉(zhuǎn)移危險及患者的存活時間［12］。cyclinD1是細胞周期G1/S期監(jiān)控點重要的正向調(diào)控因子，其通過激活細胞周期依賴性蛋白激酶，進而活化下游的信號分子促進DNA合成，加快細胞由G1期進入S期，從而導(dǎo)致細胞失控性生長［13］，與多種腫瘤的發(fā)生有密切關(guān)系。

本研究發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染NS4B的肝癌細胞PCNA及cyclinD1表達均明顯增強，提示HCV-NS4B蛋白可能促進PCNA及cyclinD1表達，促使更多細胞越過G1/S期監(jiān)控點而進入S期，促進細胞異常增殖，參與肝癌的發(fā)生。

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