HPLC-MS/MS聯用技術定量測定人血漿中伊伐布雷定及其代謝產物

賈艷艷，鹿成濤，宋 穎，丁莉坤，楊 靜，陳敏純，李雪晴，宋 薇，周 倫，馮智軍，文愛東

（中國人民解放軍第四軍醫大學第一附屬醫院藥劑科，陜西 西安710032）

HPLC-MS/MS聯用技術定量測定人血漿中伊伐布雷定及其代謝產物

賈艷艷，鹿成濤，宋 穎，丁莉坤，楊 靜，陳敏純，李雪晴，宋 薇，周 倫，馮智軍，文愛東

（中國人民解放軍第四軍醫大學第一附屬醫院藥劑科，陜西 西安710032）

為了定量測定人血漿中伊伐布雷定和去甲伊伐布雷定濃度，建立了HPLC-MS/MS聯用方法以地西泮為內標，V（甲醇）∶V水（5mM醋酸銨＋1%甲酸）＝80∶20的混合溶液為流動相，Diamosil C18（150mm×4.6mm，5μm）色譜柱為分析柱，通過電噴霧離子源（ESI），以正離子多反應監測（MRM）方式檢測。用于定量分析的離子對分別為m/z469.2→177.1（伊伐布雷定），m/z455.2→177.1（去甲伊伐布雷定），m/z285.1→193.1（地西泮）。伊伐布雷定的標準曲線線性范圍為0.101 3～101.3μg/L，定量下限為0.101 3μg/L；去甲伊伐布雷定的標準曲線線性范圍為0.085～25.5μg/L，定量下限為0.085μg/L。日內、日間精密度的RSD＜15%，平均回收率＞75%。

伊伐布雷定；去甲伊伐布雷定；高效液相色譜－串聯質譜；血漿藥物濃度

鹽酸伊伐布雷定是一種減緩心率藥，起到減緩竇房結起搏點活動速度的作用，用于治療慢性穩定型心絞痛。伊伐布雷定常見的不良反應為心動過緩、房室傳導1度阻滯、室性期外收縮、頭痛、眩暈和視力模糊與其劑量存在依賴性［1－2］。伊伐布雷定在體內經肝藥酶代謝成去甲伊伐布雷定，從而發揮減慢心率的作用，是臨床常用的藥物［3－5］，但目前國內暫無伊伐布雷定及其代謝產物體內定量檢測方法的研究報道。本試驗建立了伊伐布雷定及其代謝產物在人血漿中定量檢測的方法，并用于人體藥動學研究。

1 試驗部分

1.1 主要儀器與裝置

6410型高效液相色譜－串聯質譜聯用儀：美國Agilent公司產品，其中安捷倫1200高效液相色譜系統包括二元輸液泵、自動進樣器、柱溫箱，串聯質譜儀為Agilent 6410型三重四極桿串聯質譜儀，包含電噴霧離子化源以及串聯三重四極桿質譜檢測器；色譜工作站：MassHunter數據處理軟件，美國Agilent公司產品；FA1004電子天平：上海恒平科學儀器公司產品；Milli-Q Plus純水器：美國密理博中國有限公司產品；XW-80A微型旋渦混合儀：上海滬西分析儀器有限公司產品；TGL 16G臺式離心機：上海安亭科學儀器廠產品；KS康氏振蕩器：江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司產品。

1.2 主要試劑

鹽酸伊伐布雷定對照品（含量99.13%，批號：YF-D01），鹽酸去甲伊伐布雷定對照品（含量99.13%，批號：091007）：由常州四藥制藥有限公司提供；地西泮對照品（內標，批號：100294-200602）：由中國藥品生物制品檢定所提供；甲醇，磷酸（色譜純）：美國Fisher公司產品；水：自制純化水；空白血漿：由第四軍醫大學第一附屬醫院提供；實驗用水為去離子水，實驗室自制。

1.3 HPLC-MS/MS分析條件

1.3.1 色譜條件 色譜柱：迪馬公司DIAMOSIL C18（150mm×4.6mm，5μm）；流動相：V（甲醇）∶V 水（5mmol/L醋酸銨＋0.1%甲酸）＝80∶20的混合溶液；流速0.6mL/min；柱溫40℃；進樣量5μL。

1.3.2 質譜條件 電噴霧離子化源（ESI源），正離子模式檢測，多反應監測（MRM）方式，毛細管電壓4 000V，駐留時間150ms，干燥氣溫度325℃，干燥氣流速12L/min，霧化氣壓力345kPa。以多反應監測的質譜掃描方式分析，測定伊伐布雷定，用于定量分析的離子對m/z 469.2→177.1，碰撞電壓25eV，裂解電壓140 V；去甲伊伐布雷定，用于定量分析的離子對m/z455.2→177.1，碰撞電壓23eV，裂解電壓140 V；地西泮（內標），用于定量分析的離子對m/z 285.1→193.1，碰撞電壓32eV，裂解電壓150 V，所得的質譜圖示于圖1。

1.4 試驗步驟

1.4.1 血漿樣品的處理 精密量取1mL血漿樣品于10mL玻璃離心管中，加入50μL內標溶液（2mg/L地西泮溶液），旋渦30s后混勻，加入4mL乙酸乙酯，渦漩3min，以4 000r/min離心10min。吸取有機層，在30℃水浴中以氮氣流吹干，殘渣以200μL流動相復溶，以16 000 r/min離心8min，吸取上清液轉移至自動進樣器樣品管中，進樣量5μL，進行 LC-MS/MS分析。

1.4.2 標準曲線和質控樣品的制備 精密稱量11.01mg鹽酸伊伐布雷定標準品 （含10.13mg伊伐布雷定標準品），置于10mL棕色容量瓶中，用甲醇定容，得伊伐布雷定濃度為1.013 g/L，作為儲備液備用，然后用空白血漿依次稀釋配制 成 濃 度 為 0.101 3、0.303 9、1.013、3.039、10.13、30.39、101.3μg/L的標準含藥血漿。按照1.4.1方法進行處理并測定。同樣步驟再次配制濃度為0.202 6、5.065、75.975μg/L的質控樣品。

圖1 伊伐布雷定、去甲伊伐布雷定及內標地西泮質譜圖Fig.1 Mass spectrum of ivabradine，N-desmethylivabradine and Diazepam（IS）

精密稱取4.63mg鹽酸去甲伊伐布雷定標準品 （內含4.25mg去甲伊伐布雷定），置于10 mL容量瓶中，加入甲醇稀釋至10mL，溶解搖勻，即得0.425g/L伊伐布雷定的儲備液，然后用空白血漿依次稀釋配制成濃度為0.085、0.255、0.85、2.55、8.5、17、25.5μg/L 的標準含藥血漿。按照1.4.1方法進行處理并測定。同樣步驟再次配制濃度為0.17、2.55、12.75μg/L的質控樣品。

1.4.3 穩定性考察 在不同的試驗條件下對質控樣品進行穩定性試驗（n＝3）：1）質控樣品在－80℃冰箱中完全冷凍后取出，在室溫環境下解凍，然后再次放入冰箱，如此反復3次后制備并測定；2）質控樣品在室溫下放置4h后制備并測定；3）質控樣品在－80℃下避光保存，1個月后制備并測定；4）質控樣品在進樣器放置4h后制備并測定。

2 方法與結果

2.1 特異性考察

分別取6個不同受試者的1mL空白血漿，除不加入內標溶液外，其余按血漿樣品分析方法處理，進樣5μL，獲得空白樣品的色譜圖，示于圖2a；將一定濃度的伊伐布雷定標準溶液、去甲伊伐布雷定標準溶液和內標地西泮溶液加入空白血漿中，用相同的方法進行樣品處理，獲得相應的色譜圖，示于圖2b；受試者服藥5mg伊伐布雷定片0.5h后的色譜圖示于圖2c。結果表明，空白血漿中的內源性雜質并未干擾伊伐布雷定、去甲伊伐布雷定和內標的測定。

圖2 血漿中伊伐布雷定、去甲伊伐布雷定、地西泮的典型多反應監色譜圖Fig.2 Representative chromatograms for ivabradine，N-desmethylivabradine，and IS.

2.2 基質效應考察

分別用甲醇配制相當于血漿濃度0.202 6、5.065、75.975μg/L的伊伐布雷定樣品各1 mL，相當于血漿濃度0.17、2.55、12.75μg/L的去甲伊伐布雷定樣品各1mL，加入50μL內標，每種濃度各做10份，以氮氣吹干。其中5份樣品以200μL流動相復溶，另外5份以空白血漿提取液復溶，以16 000r/min離心8min，移取上清液至自動進樣瓶，進樣分析，流動相復溶峰面積比值平均值記為fR，空白血漿提取液復溶樣品峰面積記為fs，按下式計算基質效應（RE），RE＝（fs/fR）×100%。結果顯示：伊伐布雷定高、中、低3個濃度的基質效應分別為2.8%、2.1%、3.7%，去甲伊伐布雷定高、中、低3個濃度的基質效應分別為2.5%、1.7%、6.3%，RSD均小于15%，可認為沒有基質效應干擾。

2.3 標準曲線和線性范圍

以待測化合物和內標峰面積為縱坐標，濃度為橫坐標，權重系數1/x，進行線性回歸計算，得到伊伐布雷定標準曲線：f＝0.003 848＋0.057 28C，線性相關系數r為0.998；去甲伊伐布雷定標準曲線：f＝0.001 061＋0.019 807C，線性相關系數r為0.999，而且各點標示濃度和計算濃度的偏差都在±15μg/L以內（最低定量限為±20μg/L）。伊伐布雷定的最低定量（LLOQ）濃度為0.101 3μg/L，其日內精密度RSD為10.8%，日間精密度RSD為5.4%；去甲伊伐布雷定的最低定量濃度為0.085μg/L，其日內精密度RSD為8.4%，日間精密度RSD為4.7%，符合要求。

2.4 精密度和準確度

方法學考核伊伐布雷定濃度為0.202 6、5.065、75.975μg/L的質控樣品（n＝6），去甲伊伐布雷定濃度為0.17、2.55、12.75μg/L的質控樣品（n＝6），考核批次為3次，結果列于表1。結果表明，此方法的精密度和準確度偏差均在±15%以內。

2.5 穩定性

分別在－80℃反復凍融3次、血漿室溫放置4h、－80℃下凍存3個月、進樣器放置4h（n＝3），4種條件下考察方法的穩定性，結果列于表2。結果表明，伊伐布雷定及去甲伊伐布雷定在這4種條件下的穩定性良好。

表1 伊伐布雷定和去甲伊伐布雷定的回收率和精密度Table 1 Precision and recovery of ivabradine and N-desmethylivabradine

表2 伊伐布雷定和去甲伊伐布雷定的穩定性Table 2 Stability of ivabradine and N-desmethylivabradine

2.6 提取回收率試驗

取10mL玻璃離心管數支，分別加入不同量的伊伐布雷定和去甲伊伐布雷定標準溶液，以氮氣流吹干，加入2.5mL空白血漿提取液，配制成含0.202 6、5.065、75.975μg/L伊伐布雷定血漿樣品及含0.17、2.55、12.75μg/L去甲伊伐布雷定血漿樣品，渦漩混勻后，按1.4.1處理，記錄色譜圖，計算峰面積比值fi（fi＝As/Ai）。并計算每種濃度的平均值。

取10mL玻璃離心管數支，配成含0.202 6、5.065、75.975μg/L的含伊伐布雷定血漿標準樣品及含0.17、2.55、12.75μg/L的去甲伊伐布雷定血漿標準樣品，每種濃度各做5份，除不加內標外，按1.4操作，取上清液2.5mL，加入50μL內標標準液，渦漩后，于35℃水浴中以氮氣流吹干，用200μL流動相復溶，以16 000 r/min離心3min，移取上清液至自動進樣器，5 μL進樣分析，記錄色譜圖，計算峰面積比值fs（fs＝As/Ai）。將上述fs和的比值代入下式，即可求得伊伐布雷定的絕對回收率（R%），R%結果列于表3。

表3 伊伐布雷定、去甲伊伐布雷定的提取回收率Table 3 Recovery of ivabradine andN-desmethylivabradine

2.7 方法應用

應用本方法測定10名中國成年健康志愿者單劑量口服5mg鹽酸伊伐布雷定后，不同時間血漿中伊伐布雷定和去甲伊伐布雷定的濃度，并計算藥代動力學參數，其平均血藥濃度－時間曲線示于圖3。藥代動力學參數結果為：伊伐布雷定t1/2：（5.18±1.20）h，AUC（0－48）：（169.56±33.15）（μg·h）/L，Cmax：（35.88±8.88）μg/L，tmax：（1.08±0.53）h；代謝產物去甲伊伐布雷定t1/2：（9.91±1.24）h，AUC（0－48）（23.87±9.43）（μg·h）/L，Cmax為（3.11±1.62）μg/L，tmax：（1.30±0.26）h。

圖3 健康志愿者口服5mg伊伐布雷定片后的平均血藥濃度－時間曲線Fig.3 Mean plasma concentration-time profiles of ivabradine and N-desmethylivabradine after single oral dose of 5mg ivabradine hydrochloride tablets

3 討論

目前國際上有3篇關于伊伐布雷定及去甲伊伐布雷定檢測方法研究報道，其中1篇為熒光檢 測 法［6］，2 篇 為 質 譜 聯 用 法［7－8］。 但 鑒 于 伊 伐布雷定及去甲伊伐布雷定的檢測下限較低，采用質譜聯用法較為妥當，但上述2篇研究報道均采用固相萃取處理方法，成本較高，不適用于大批樣品的預處理。針對上述情況，本試驗建立了液液萃取的樣品預處理方法，成本低廉、重現性高、易于操作，且血漿中的雜質不干擾樣品的測定。伊伐布雷定的標準曲線線性范圍為0.101 3～101.3μg/L，去甲伊伐布雷定的標準曲線線性范圍為0.085～25.5μg/L，線性關系良好；伊伐布雷定、去甲伊伐布雷定的高、中、低3個濃度的批內和批間精密度均小于15%；相對回收率在98.7～108.2%之間；伊伐布雷定、去甲伊伐布雷定血漿樣品室溫放置4h，－80℃下反復凍融3次，－80℃下凍存3個月及檢測樣品進樣器放置4h條件下的穩定性良好，符合生物樣品分析要求。此外，目前國際上有2篇關于伊伐布雷定與其他藥物相互作用的文章［9－10］，報道了肝藥酶誘導劑卡馬西平可提高伊伐布雷定的生物利用度高近80%，但主經肝藥酶CYP3A4和CYP2C19代謝的奧美拉唑并不影響伊伐布雷定代謝，兩者之間不存在任何相互作用，上述研究均提示在臨床應用過程中需注意伊伐布雷定的應用，避免因藥物相互作用而出現不良反應。

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Quantitative Determination of Ivabradine and N-Desmethylivabradine in Human Plasma by HPLC-MS/MS

JIA Yan-yan，LU Cheng-tao，SONG Ying，DING Li-kun，YANG Jing，CHEN Min-chun，LI Xue-qin，SONG Wei，ZHOU Lun，FENG Zhi-jun，WEN Ai-dong
（Department of Pharmacy，the First Affiliated Hospital of Fourth Military Medical University of PLA，Xi’an710032，China）

Ivabradine and N-desmethylivabradine in human plasma was determined by high performance liquid chromatography coupled with tandem mass spectrometry （HPLC-MS/MS）.Diazepam was used as internal standard.Ivabradine and N-desmethylivabradine was separated on a Diamosil C18column（150mm×4.6mm×5μm）.Electrospray ionization（ESI）source was applied，and multiple reaction monitoring（MRM）mode was operated in the positive mode with the monitor ions at m/z469.2→177.1for ivabradine，m/z455.2→177.1for N-desmethylivabradine and m/z285.1→193.1for the interna1standard，respectively.The linear calibration curve are obtained over the concentration range of 0.101 3—101.3μg/L for ivabradine and 0.085—25.5μg/L for N-desmethylivabradine.The limit of quantitation are 0.101 3μg/L and 0.085μg/L for ivabradine and N-desmethylivabradine，respectively.The inter-day and intra-day precision（RSD）is less than 15%.The average recoveries are above 75%.

ivabradine；N-desmethylivabradine；high performance liquid chromatography coupled with tandem mass spectrometry（HPLC-MS/MS）；plasma concentration

O 657.63

A

1004-2997（2012）03-0081-06

2011-10-05；

2011-12-14

賈艷艷（1981～），女（漢），河北遵化人，主管藥師，從事臨床藥理學研究。E-mail：jiayanyan-2004＠hotmail.com。

文愛東（1965～），男（漢），陜西西安人，主任藥師，從事臨床藥理學研究。E-mail：adwen-2004＠hotmail.com