超高效液相色譜-串聯四極桿飛行時間質譜法篩查飼料中11種鎮靜劑類藥物

吳寧鵬，班付國，彭 麗，周紅霞，劉占通，劉宏偉

(河南省獸藥監察所，河南 鄭州 450008)

2011-09-02；

2012-02-23

吳寧鵬(1974～)，男(漢族)，獸醫師，從事獸藥飼料檢測工作。E-mail：wnppeking2002@163.com

超高效液相色譜-串聯四極桿飛行時間質譜法篩查飼料中11種鎮靜劑類藥物

吳寧鵬，班付國，彭 麗，周紅霞，劉占通，劉宏偉

(河南省獸藥監察所，河南 鄭州 450008)

為了快速篩查未知飼料樣品中的鎮靜劑類藥物，應用超高效液相色譜-串聯四極桿飛行時間質譜建立了篩查飼料中11種鎮靜劑類藥物的方法。在不同添加濃度下獲得了精確的分子離子質量，質量偏差的絕對值低于3×10-6。11種鎮靜劑類藥物在0.02～1 mg/L范圍內線性關系良好，相關系數r≥0.99，添加濃度為0.5～5 mg/kg時，其添加回收率在50%～120%之間，在飼料基質中的檢測限為0.1 mg/kg。該方法簡便、高效、準確，適于飼料中11種鎮靜劑類藥物的分析檢測需求。

超高效液相色譜-串聯四極桿飛行時間質譜； 鎮靜劑類藥物； 篩查； 飼料

鎮靜劑類藥物(sedatives)是指對中樞神經系統有抑制作用，從而減輕或消除動物狂躁不安癥狀，或令其恢復安靜的一類藥物，主要用于興奮不安或具有攻擊性行為的動物或患畜，以使其安靜，便于工作或治療[1]。隨著鎮靜劑類藥物在獸醫臨床上的廣泛應用，近年來，一些不法飼料生產企業因經濟利益的驅使，擅自在畜禽飼養過程中添加此類藥物以起到鎮靜催眠、增重催肥、縮短出欄時間的作用；另外，在動物運輸過程中，為減少動物死亡和體重下降，防止肉品質降低，也常使用此類藥物以減少應激帶來的損失。但非法使用此類藥物會使其原形和代謝產物不可避免地殘留于動物源食品中，人們食用了這些食品后會對人體中樞神經系統等造成不良影響，因此許多國家都將此類藥物列為禁用藥物，我國也規定鎮靜劑類藥物不允許在飼料中添加使用。但由于鎮靜劑類藥物品種較多，我國飼料生產企業眾多，很難掌握在生產飼料時添加藥物情況，因此開發篩查飼料中鎮靜劑藥物的方法尤為重要。

目前，對鎮靜劑類藥物的檢測方法有HPLC[2-4]、GC/MS[5]、LC-MS/MS[6-12]法。由于飼料中非法添加藥物的復雜性，快速篩查飼料中的違禁藥物已經成為研究的熱點。隨著液相色譜-飛行時間質譜(LC-TOF、LC-QTOF)技術的日趨成熟和推廣應用，利用飛行時間質譜測定精確質量，實現對未知飼料樣品中的藥物篩查檢測已經成為可能。質量測定的精確度越高，理論上越可以減少可能的目標化合物數量，從而增強對非法添加藥物確認的可信度。本研究利用超高效液相色譜-串聯四極桿飛行時間質譜(UPLC-QTOF)技術，建立了飼料中鎮靜劑類藥物的快速篩查檢測方法。

1 材料和方法

1.1儀器

超高效液相色譜-串聯四級桿飛行時間質譜儀：美國Waters公司產品，配有電噴霧離子源；分析天平(感量0.01 mg)： 瑞士Mettle公司產品。

1.2試劑

氯丙嗪、阿扎哌隆、賽拉嗪、地西泮、艾司唑侖、奧沙西泮、硝基安定、奮乃靜、氟哌啶、氟哌啶醇、異丙嗪等標準品(含量均大于98%)：購自百靈威公司；甲醇、乙腈為色譜純；其他試劑均為分析純。

1.3對照溶液的配制

準確稱取適量的氯丙嗪、阿扎哌隆、賽拉嗪、地西泮、艾司唑侖、奧沙西泮、硝基安定、奮乃靜、氟哌啶、氟哌啶醇、異丙嗪標準品，用甲醇溶解并定容，配制成1 g/L的標準儲備液，用乙腈分別將其稀釋成相應的標準工作溶液。

1.4試驗方法

1.4.1色譜條件 色譜柱：C18(100 mm×2.1 mm×1.7 μm)； 流動相A為甲醇，流動相B為0.1%甲酸水溶液；流速：0.3 mL/min；柱溫：30 ℃；進樣量：5 μL；樣度洗脫程序列于表1。

表1 梯度洗脫程序

1.4.2質譜條件 電噴霧離子源，正離子模式；毛細管電壓3.00 kV；錐孔電壓30 V；離子源溫度110 ℃；脫溶劑溫度350 ℃；脫溶劑氣流速650 L/h；錐孔反吹氣流速50 L/h；質量掃描范圍m/z80～1 000；亮氨酸腦啡肽實時在線分子質量校正，相對分子質量556.277 1，流速0.2 mL/min。

1.4.3樣品前處理 稱取2 g飼料，加入1 mL飽和乙酸鉛和9 mL 0.1%V(甲酸)∶V(甲醇)=3∶7的溶液，渦旋1 min，超聲10 min，以8 000 r/min離心10 min，上清液過0.22 μm濾膜后，上機測定。選取空白飼料，通過添加已知含量的鎮靜劑類藥物制備陽性樣品進行添加回收試驗。測定數據用Waters公司的藥物篩查軟件MassLynx V 4.1進行分析。

1.4.4實際樣品檢測 對從市場上抽檢的60份飼料樣品進行篩查檢測，未檢出陽性樣品。

2 實驗結果

2.1標準曲線及回收率

按照上述方法繪制標準曲線，飼料基質中11種藥物的線性方程和相關系數列于表2，回收率及精密度列于表3。從表2、3可以看出，各藥物在0.02～1.0 mg/L濃度范圍內呈良好線性相關，相關系數均大于0.99。

2.2藥物篩查結果

優化錐孔電壓，以獲得最大的分子離子豐度，測得藥物的精確分子質量與實際分子質量的偏差絕對值均小于3×10-6，數據列于表4。

2.3質量準確度的測定

11種鎮靜劑類藥物混合標準溶液的總離子流圖示于圖1。在本研究選定的條件下，應用高精度的質量提取可以獲得良好的提取離子色譜圖，示于圖2。根據分子離子峰的精確質量數，經Waters公司MassLynx V 4.1軟件匹配元素組成示于圖3。

表2 飼料基質溶液中11種鎮靜劑類藥物的線性方程及相關系數Table 2 The linear equation andcorrelation coefficients of 11 sedatives in feedstuff

表3 飼料基質溶液中11種鎮靜劑類藥物的回收率及精密度

注：*為添加濃度，單位為mg/kg

圖1 飼料基質中添加0.1 mg/kg鎮靜劑類藥物的總離子流圖 Fig.1 Total ion current chromatogram of a feed spiked with standards at 0.1 mg/kg for each sedative

表4 飼料基質中測得的11種鎮靜劑類藥物的精確質量數及相關數據

圖2 飼料基質中氯丙嗪的提取離子色譜圖 Fig.2 Extracted ion current chromatogram of chlorpromazine in feed

2.4實際樣品篩查

對從市場上抽檢的60份飼料樣品進行篩查，其中有兩份為可疑陽性樣品，經LC-MS/MS確認后，均為陰性樣品。

3 討論

3.1儀器條件的優化

對質譜的各種參數進行優化，以獲得最佳的靈敏度。錐孔電壓是影響分子離子峰的關鍵參數，分別對20～40 V錐孔電壓進行優化，在固定碰撞電壓的條件下，實驗得出在30 V的錐孔電壓下，各藥物的分子離子峰為最高。

3.2質量測定的準確度

在飼料樣品中添加0.1 mg/kg濃度下，各藥物的提取離子仍能得到一張很干凈的圖譜，各種藥物測得的精確分子質量與實際精確分子質量的差值都小于3×10-6，說明該方法在飼料基質中獲得的質量精度仍較高。通過軟件設定的質量偏差和元素組成的種類及數量，可以直接獲得可能的分子式組成，而分子離子的精確質量可以有效地減少可能的分子式組成數，提高對未知物篩查的效率。

3.3目標化合物的確證

本研究根據保留時間、精確質量數、元素組成和i-FIT值，即可完成對未知鎮靜劑的確證分析。氯丙嗪的精確分子質量為319.103 6，測定的分子質量為319.104 3，經軟件分析后，元素組成與氯丙嗪的元素組成一致，其i-FIT為最小。同位素峰的存在能進一步確證篩查結果，圖3中有明顯的氯丙嗪同位素峰，其中m/z319.104 3(100%)，m/z321.101 1(33.6%)的質量數相差為2，豐度比為3:1，符合化合物中含有1個氯原子的規律。另外，由于本方法是一個開放的體系，可以增加目標化合物的分子式和保留時間的數據庫，一次進樣，即可完成所有化合物的篩查。篩查出的陽性樣品再經LC-MS/MS確證。

圖3 應用Waters公司軟件匹配飼料基質中氯丙嗪的元素組成 Fig.3 Elemental composition of chlorpromazine in feed by Waters Company software

4 結論

研究結果表明，UPLC-QTOF是篩查飼料中鎮靜劑類藥物的有效手段，測定質量精確度多數優于3×10-6，因此能夠滿足篩查的準確性要求。此外，還具有良好的選擇性和靈敏性，不僅可以用于飼料的篩查檢測，還可以擴展到畜產品中農獸藥殘留、獸藥制劑中非法添加物等的篩查檢測。篩查檢測中的陽性結果可以通過液相色譜-串聯質譜儀進行進一步的確證和定量分析。隨著人們對食品安全關注度的增加，對畜產品以及飼料、獸藥等投入品中的有毒有害物質篩查也會越來越重視。UPLC-QTOF能夠提供精確分子質量，具有廣闊的應用前景。

[1] 李俊鎖，邱月明，王 超,著.獸藥殘留分析[M]. 上海：上海科學技術出版社，2002：340-361.

[2] SAMIA M, GIZAWY E. Simultaneous determination of diazepam, oxazepam and temazepam in spiked urine by HPLC [J]. Anal Lett, 2000, 33(4):629-638.

[3] MOHAMMAD N. Validation of SPE-HPLC determination of 1,4-benzodiazepines and metabolites in blood plasma,urine and saliva[J]. J Sep Sci, 2008(31): 3 704-3 717.

[4] MASATOMO M. Determination of estazolam in plasma by high-performance liquid chromatograghy with solid-phase extraction[J]. Anal Sci, 2002(18):525-528.

[5] TEEMU G. Determination of 14 benzodiazepines and hydroxy metabolites, zaleplon and zzolpidem astert-butyldimethylsilyl derivatives compares with other common silylating reagents in whole blood by gas chromatography-mass spectromery[J]. J Chromatogr B， 2005， 828： 175-189.

[6] WANG J Y. Simple and sensitive liquid chromatography/tandem mass spectrometry method for the determination of diazepam and its major metabolites in rat cerebrospinal fluid[J]. Rapid communication in mass sprctrometry, 2003， 17： 519-525.

[7] SKINNER W. Quantitative determination of carisoprodal and its metabolites in equine urine and serm by liquid chromatography tandem mass spectrometry[J]. Chromatogr Suppl, 2004，59: S61-S67.

[8] TOSHIMASA T. Determination of hypnotic ben-zodiazepines(alprozalam, estazolam, and midazolam) and their metabolites in rat hair and plasma by reverse-phase liquid-chromatography with electrospray ionization mass spectrometry [J]．Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 2003， 30: 1 773-1 787.

[9] LIU Z． The simultaneous determination of diazepam and its three metabolites in dog plasma by high-performance liquid chromatograohy with mass spectroscopy detection [J]．Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 2001， 26: 321-330.

[10] STEPHANE P. Liquid chromatographic-electrospray ionization mass spectromrtric quantitative analysis of buprenorphine, norbuprenorphine, nordiazepam and oxazepam in rat plasma[J]. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 2006， 41: 1 135-1 145.

[11] HEGSTAD S. Determination of benzodiazepines in human urine using solid-phase extraction and high-performance liquid chromatography-electrospray ionization tandem mass spectrometry[J]. Journal of Analytical Toxicology, 2006， 30: 31-37.

[12] FENG J.Simultaneous determination of multiple drugs of abuse and relevant metabolites in urine by LC-MS-MS[J].Journal of Analytical Toxicology. 2007， 31： 359-368.

ScreeningMethodfor11SedativesinFeedstuffbyUltraPerformanceLiquidChromatography-QuadrupoleTime-of-FlightMassSpectrometry

WU Ning-peng, BAN Fu-guo, PENG Li, ZHOU Hong-xia, LIU Zhan-tong, LIU Hong-wei

(He’nanInstituteofVeterinaryDrugControl,Zhengzhou450008，China)

A method based on ultra performance liquid chromatography-quadrupole time-of-flight mass spectrometry (UPLC-QTOF) was developed for quantitative analysis of 11 sedatives in feedstuff. The accurate mass was obtained in different spiking levels (from 0.5 to 5 mg/kg)and the accuracy error was lower than 3×10-6, which was well within the accepted limits for target confirmation. The linearity of response ranges from 0.02 to 1.0 mg/L， and the correlation coefficient is greater than 0.99. The average recoveries range from 50% to 120% of the fortified 11 sedatives in feedstuff at 0.5—5 mg/kg levels. and the limits of detection are 0.1 mg/kg. The results indicate that the method is easy, fasty, and sensitive. This method can meet the requirements for simultaneous determination of 11 sedatives in feedstuff.

ultra performance liquid chromatography-quadrupole time-of-flight mass spectrometry (UPLC-QTOF); sedatives; screening; feedstuff

O 657.63

A

1004-2997(2012)03-0094-05