中藥中多糖類成分研究概述

崔 寧，郭 威，孫曉園，于宗淵

(1.山東中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，山東濟(jì)南250355;2.山東省中醫(yī)藥研究院，山東濟(jì)南250014;3.山東大學(xué)校醫(yī)院，山東濟(jì)南250100)

中藥中多糖類成分具有廣泛的藥理活性，如調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能、抗腫瘤、抗病毒、抗疲勞、抗糖尿病、降血脂、抗氧化、抗凝血、抗炎等［1］，因而受到了越來越多的重視。為了對(duì)中藥中多糖類成分的研究現(xiàn)狀有一個(gè)較全面、深入的了解，系統(tǒng)查閱了有關(guān)文獻(xiàn)，對(duì)中藥中多糖類成分的提取、分離純化、結(jié)構(gòu)解析及活性測(cè)定等方面研究內(nèi)容進(jìn)行了綜述，并在此基礎(chǔ)上，指出了目前存在的問題及今后研究的主要方向。

1 多糖的提取

從中藥中提取多糖之前，一般先用石油醚、乙醚等有機(jī)溶劑處理藥材，以去除脂溶性成分;后用95%乙醇去除單糖、苷類等小分子物質(zhì);對(duì)于色素含量較高的根、莖、葉、果實(shí)類藥材，還需進(jìn)行脫色處理［2］。

最常用的多糖提取方法為熱水提取法。即向預(yù)處理后的藥材中加入一定量的蒸餾水，在加熱回流或恒溫條件下提取多糖。為了提高多糖的提取率，一般采用兩種改進(jìn)方法，一種是向提取用水中加入酶類，如纖維素酶、蛋白酶等，使細(xì)胞壁損壞，獲得更多胞內(nèi)多糖［2］;另一種是采用弱堿水［3］或弱酸水［4］提取多糖，分別獲得更多的酸性多糖與堿性多糖。此外，還可采用超聲波［5］或微波［6］提取法，增大物質(zhì)分子的運(yùn)動(dòng)頻率和速度，增加溶劑穿透力，從而提高多糖的浸出率。

在選定提取方法后，為了進(jìn)一步提高多糖的提取效率，應(yīng)進(jìn)行工藝條件優(yōu)化。姜波等［7］通過單因素和正交試驗(yàn)，以多糖的質(zhì)量和含量為指標(biāo)，考察了固液比、提取溫度、提取時(shí)間及提取次數(shù)對(duì)五味子多糖得率的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，提取溫度對(duì)五味子多糖得率的影響最大，而固液比和提取時(shí)間次之;最終得五味子多糖提取的最佳工藝條件為:固液比1∶30，提取溫度90℃，提取時(shí)間4 h，提取3次。Cai等［8］采用3 ×3 Box－Behnken設(shè)計(jì)與響應(yīng)曲面法(RSM)分析，優(yōu)化仙人掌多糖的最佳提取工藝，確定最佳工藝條件為:提取溫度86.1℃，提取時(shí)間3.61 h，料水比1∶3.72。

2 多糖的分離與純化

由于提取的粗多糖中往往含有較多的蛋白質(zhì)，所以在多糖進(jìn)一步純化之前，必須除去其中的蛋白質(zhì)。常用的除蛋白方法有三氯乙酸法、酶解法、Sevag法及柱色譜法(如大孔樹脂柱色譜、聚酰胺柱色譜)等，其中以Sevag法最為多見。Sevag法具有條件溫和、多糖降解損失少等優(yōu)點(diǎn)。王文平等［2］以蛋白含量和多糖含量為指標(biāo)，分別采用Sevag法、酶解與Sevag 相結(jié)合的方法及三氯乙酸法去除野木瓜粗多糖中的蛋白質(zhì)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，采用酶解與Sevag相結(jié)合的方法脫蛋白，多糖含量有所提高，蛋白脫除效果好，既減少了常規(guī)Sevag法的操作次數(shù)，又避免了三氟乙酸法脫蛋白過程中造成的多糖降解損失。

多糖提取液去蛋白后，一般先經(jīng)一定濃度乙醇沉淀獲得粗多糖，后進(jìn)行柱色譜分離，最終獲得純化多糖。

多糖的柱色譜分離過程一般先采用弱陰離子交換柱色譜，將總多糖分為中性糖與若干酸性糖組分，后經(jīng)凝膠柱色譜分離，最終獲得分子量相對(duì)較均一的純化多糖。常用的陰離子交換柱色譜填料有 DEAE－Sepharose F.F、DEAESepharose CL、DEAE－纖維素、DEAE－Sephadex A等;常用的凝膠柱色譜填料有Sephadex、Sepharose、Sephacryl等。

Wang等［9］對(duì)絞股藍(lán)粗多糖先進(jìn)行DEAE－Sepharose CL－6B柱色譜分離，后以Sephadex G－100柱色譜精制，得到3個(gè)多糖組分;經(jīng)醋酸纖維素薄膜電泳鑒定，3個(gè)多糖組分均呈現(xiàn)單一斑點(diǎn)，證明三組分均為均一絞股藍(lán)多糖。刺五加粗多糖經(jīng)DEAE－Sepharose F.F陰離子交換柱色譜分離后，獲得三個(gè)多糖組分，將其中主要組分經(jīng)Sephadex G－75凝膠柱色譜洗脫得到單一對(duì)稱尖峰，證明該組分為均一刺五加多糖［10］。

3 多糖的結(jié)構(gòu)解析

3.1 多糖的分子量測(cè)定 多糖的分子量測(cè)定多采用高效凝膠滲透色譜法(HPSEC)，它利用了多糖的分子量與其在凝膠色譜柱上的洗脫體積之間成一定關(guān)系的性質(zhì)。但應(yīng)注意的是，多糖的分子量僅代表相似鏈長的平均分布，采用不同方法往往測(cè)得不同分子量。即使是同一種多糖，其重均分子量和數(shù)均分子量也會(huì)相差較大。近年來，凝膠滲透色譜－多角度激光光散射儀聯(lián)用技術(shù)(SEC－LLS)迅速發(fā)展，已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于高分子化學(xué)、生物化學(xué)等眾多研究領(lǐng)域。其工作原理為樣品先經(jīng)凝膠滲透色譜將其中高分子物質(zhì)按照分子量的大小依次洗脫下來，后直接激光照射測(cè)定其散射光強(qiáng)度，由于散射光強(qiáng)度強(qiáng)烈依賴于高分子的分子量、鏈形態(tài)、溶液濃度、散射光角度和折光指數(shù)增量(dn/dc值)等基本參數(shù)，因此可間接得知高分子物質(zhì)的絕對(duì)分子量。SEC－LLS除了可以得知平均分子量，還可以測(cè)得不同高分子物質(zhì)的分布及其相應(yīng)分子量大小，并且不需要使用結(jié)構(gòu)相似的標(biāo)準(zhǔn)品做標(biāo)準(zhǔn)曲線、具有測(cè)定范圍廣泛、準(zhǔn)確度高等優(yōu)點(diǎn)。

Huang等［11］采用HPSEC法測(cè)定靈芝中性均一多糖的平均分子量(Mw)約為2.5×106kDa。賀鋒嘎等［12］采用SECLLS分析芥菜多糖的分子量范圍及其分布，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，芥菜多糖的分子量在1.42×104～2.55×105kDa之間，80%的多糖組分集中在2.1×105kDa左右。

3.2 多糖的結(jié)構(gòu)解析 多糖的結(jié)構(gòu)十分復(fù)雜，糖單體之間有多種鏈接方式，可以形成不同構(gòu)型的直鏈和支鏈結(jié)構(gòu)，再通過分子間氫鍵和基團(tuán)的相互作用可進(jìn)一步形成不同形式的高級(jí)結(jié)構(gòu)。隨著理化檢測(cè)手段和儀器性能不斷發(fā)展，多糖的結(jié)構(gòu)測(cè)定方法不斷完善，表1［13］列舉了目前多糖結(jié)構(gòu)解析的常用技術(shù)方法。通過各技術(shù)方法的選擇使用與巧妙配合，可得到來自各個(gè)角度的信息和數(shù)據(jù)，從而構(gòu)成推斷糖鏈結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)。

表1 測(cè)定多糖結(jié)構(gòu)常用的技術(shù)方法

Bao等［14］從靈芝孢子中分離得一葡聚糖，重均分子質(zhì)量為1.0×104，主鏈為(1→3)－β－D－葡聚糖，在主鏈的C－6位置有一個(gè)、兩個(gè)和幾個(gè)葡萄糖取代，通過甲基化分析、Smith降解、1D和2D－NMR、電噴霧質(zhì)譜(ESI－MS)確定了其復(fù)雜的結(jié)構(gòu)。PL－1和PL－2是來自于靈芝［15］的兩個(gè)雜多糖，經(jīng)結(jié)構(gòu)分析PL－1主鏈為(1→4)連接的α－D－葡萄糖殘基和(1→6)連接的β－D－半乳糖殘基，在葡萄糖O－6位和半乳糖的O－2位有分枝，分枝由末端葡萄糖、(1→6)連接的葡萄糖殘基和末端鼠李糖組成;PL－4由(1→3)、(1→4)、(1→6)連接的－β－D－葡萄糖殘基和(1→6)連接的β－D－半乳糖殘基組成。

4 多糖的藥理作用

4.1 抗腫瘤活性 多糖的抗腫瘤作用可通過兩種方式實(shí)現(xiàn)，第一，多糖直接作用于腫瘤細(xì)胞，使其死亡或加速凋亡;第二，多糖通過增強(qiáng)機(jī)體免疫系統(tǒng)功能，間接誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。Xin等［16］發(fā)現(xiàn)，遠(yuǎn)志多糖可顯著抑制人卵巢癌細(xì)胞SKOV 03的增殖活性，進(jìn)一步測(cè)定癌細(xì)胞內(nèi)活性氧(ROS)及谷胱甘肽(GSH)含量，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)ROS含量增加、GSH含量降低，這可能是遠(yuǎn)志多糖誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡的原因。靈芝多糖［17］則是通過增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的增殖活性與胞飲活性，間接抑制乳腺癌細(xì)胞生長，起到抗腫瘤效果。

4.2 免疫活性 多糖的免疫活性研究包括體內(nèi)和體外免疫活性研究兩方面，其中以體外免疫活性研究較為多見。體外免疫活性研究選擇的細(xì)胞主要有吞噬細(xì)胞和脾淋巴細(xì)胞兩種。其中吞噬細(xì)胞包括中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞，且以巨噬細(xì)胞的研究最深入，主要有測(cè)定其增殖活性、胞飲活性、溶酶體酶活性、NO、活性氧、TNF－α及內(nèi)毒素的分泌與釋放等。脾淋巴細(xì)胞實(shí)驗(yàn)主要通過測(cè)定其增殖水平來評(píng)價(jià)樣品的免疫活性。

Liu等［18］分離草蓯蓉多糖，獲得均一中性多糖 BRPW1與均一酸性多糖BRP－WA1和BRP－WA2。體外測(cè)定小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的吞噬活性，NO、TNF－α及內(nèi)毒素的分泌與釋放水平，發(fā)現(xiàn)草蓯蓉多糖可顯著增強(qiáng)巨噬細(xì)胞吞噬活性。進(jìn)一步結(jié)合各均一多糖的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)與活性測(cè)定結(jié)果推斷，糖醛酸含量高、分子量大且具有三螺旋構(gòu)象的多糖可能具有更強(qiáng)的巨噬細(xì)胞活性。刺五加均一多糖［10］可使ConA和LPS誘導(dǎo)的脾淋巴細(xì)胞明顯增殖，表明刺五加多糖具有顯著的免疫調(diào)節(jié)活性。

4.3 抗氧化活性 目前，體外抗氧化活性的檢測(cè)方法主要分為三類:①抗脂質(zhì)氧化類型的檢測(cè)方法，該法主要通過測(cè)定脂質(zhì)中不飽和脂肪酸的被氧化水平，來評(píng)價(jià)樣品的抗氧化活性;②清除或抑制自由基法，常用的自由基有DPPH自由基、超氧陰離子自由基、羥基自由基等;③測(cè)定抗氧化劑還原能力的檢測(cè)方法，如鐵離子還原能力(FRAP)法，該法可反映樣品的總體抗氧化能力。

Chen等［10］采用FRAP法和超氧陰離子自由基、羥基自由基、DPPH自由基清除能力測(cè)定法，分別測(cè)定刺五加粗多糖及均一多糖的抗氧化活性，結(jié)果表明，刺五加多糖具有顯著的抗氧化活性，尤以均一多糖的活性更強(qiáng)。

4.4 抗糖尿病活性 2型糖尿病的發(fā)病特征是胰島素抵抗(IR)和胰島β細(xì)胞功能障礙。現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激不僅是引起IR的關(guān)鍵機(jī)制，也與糖尿病及其并發(fā)癥的發(fā)生發(fā)展有密切聯(lián)系。PTP1B指的是肥胖癥的特異靶基因－蛋白酪氨酸磷酸酶1B，它通過對(duì)胰島素受體或其底物上的酪氨酸殘基去磷酸化作用，對(duì)胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)進(jìn)行負(fù)調(diào)節(jié)。它是一種胞內(nèi)PTP，位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，且在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激中具有重要作用;激活轉(zhuǎn)錄因子6(ATF6)為參與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)的蛋白之一。因此，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、PTP1B和ATF6均與2型糖尿病的發(fā)生發(fā)展具有直接或間接的聯(lián)系。

前期研究表明，黃芪屬植物多糖(APS)可以通過抑制PTP1B的過度表達(dá)，以提高胰島素敏感性，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)治療2型糖尿病的目的;進(jìn)一步探究其作用機(jī)制，發(fā)現(xiàn)APS在體內(nèi)不僅是一個(gè)供糖體，更能夠減輕內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激;此外，在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激過程，ATF6參與了調(diào)節(jié)PTP1B的表達(dá)，由此可得出結(jié)論，APS抑制PTP1B的表達(dá)至少部分是通過抑制ATF6的活性實(shí)現(xiàn)的［19］。

4.5 抗凝血活性 抗凝血活性的測(cè)定方法主要有活化部分凝血活酶時(shí)間測(cè)定(APTT)法、血漿凝血酶時(shí)間測(cè)定(TT)法和血漿凝血酶原時(shí)間測(cè)定(PT)法等。

Mansour等［20］采用APTT法與抗Xa因子法，探究鰩齒舌表皮多糖組分的抗凝血活性。發(fā)現(xiàn)該多糖組分硫酸化后表現(xiàn)出強(qiáng)抗凝血活性，且該活性呈現(xiàn)劑量相關(guān)性;此外，鰩齒舌表皮硫酸化多糖還具有顯著的抗Xa因子活性。Ye等［21］對(duì)海參多糖分別進(jìn)行羧甲基化和硫酸化修飾，獲得羧甲基化海參多糖和硫酸化海參多糖，進(jìn)而比較海參多糖本身與以上兩種衍生化多糖的抗凝血活性。結(jié)果表明，硫酸化多糖的抗凝血活性最強(qiáng)，且推斷這與分子結(jié)構(gòu)功能基團(tuán)的種類與所占比重有關(guān)。

4.6 其他 人參多糖［22］除了具有藥用價(jià)值外，還具有抗疲勞的保健功能;大豆低聚糖［23］可顯著降低高脂大鼠的不正常血糖、血脂水平，并可減輕氧化應(yīng)激;夏枯草多糖［24］具有抗單純皰疹病毒HSV活性;淫羊藿多糖［25］對(duì)枯草芽孢桿菌、大腸桿菌和金黃色葡萄球菌抑菌效果明顯;蓮胚芽多糖組分［26］對(duì)脂多糖(LPS)誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞發(fā)炎具有較強(qiáng)的抗炎活性;絞股藍(lán)多糖［27］可顯著抑制人皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞的增殖活性，而無細(xì)胞毒性，因而有望用于牛皮癬等疾病的預(yù)防及治療。

5 結(jié)語

中藥品種繁多，且大多數(shù)中藥中含有多糖類成分，因此，如何充分利用好這一寶貴的自然資源是目前亟待解決的課題。目前對(duì)中藥中多糖類成分的研究還存在以下主要問題:①分離純化工藝較繁瑣，成本較高，不利于工業(yè)化;②結(jié)構(gòu)研究還較膚淺，大多僅確定了部分一級(jí)結(jié)構(gòu)，而對(duì)其高級(jí)結(jié)構(gòu)未見報(bào)道;③活性研究一般用的都是粗多糖，缺乏多糖結(jié)構(gòu)與活性關(guān)系的研究。因此，實(shí)用、高效的分離純化技術(shù)研究和深入、系統(tǒng)的構(gòu)－效關(guān)系研究應(yīng)是今后中藥中多糖類成分研究的主要方向。

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