化妝品眼刺激試驗替代方法標準化與展望

敖華英，程樹軍，潘 芳，談偉君

（1.廣東出入境檢驗檢疫技術中心，廣州 510623；2.廣東藥學院，廣州 510310）

化妝品引起的局部眼刺激通常包括結膜、角膜、虹膜和淚腺的作用，其中角膜的影響排在首位，基于體內眼刺激作用發生的機制，目前已開發了多種替代方法，而單一體外實驗僅能模擬復雜眼損傷作用中的某個方面。因此，有必要根據角膜損傷的發生機制，結合體外方法的原理和標準化應用程度，對目前眼刺激試驗的諸多替代方法進行科學相關性分析與適用性綜述，為建立分層組合的替代方法策略奠定基礎，以滿足實際工作的需要。

1 眼刺激實驗替代方法的原理和分類

眼刺激作用的發生是結膜、角膜、虹膜和淚腺等眼球結構共同參與的過程，其受累范圍反映了眼刺激作用的嚴重程度。化學物對結膜的輕微刺激作用很少累及角膜，而繼發于角膜損傷引起的結膜反應通常是中等程度以上的刺激性?；诖罅炕瘜W物質體內眼刺激的實驗觀察表明，受試物暴露后最初幾小時內（一般3 h）角膜的損傷程度決定了眼睛損傷的持續時間和最終損害程度。一般來說，輕度刺激物只影響表層角膜上皮，輕度和中度刺激物主要影響上皮和表層基質，嚴重刺激物能穿透更深的基質發揮作用，甚至可能是損傷基質全部。有些遲發性化學物質（例如漂白劑）有可能在暴露1天后才造成深度損傷。角膜損傷程度與大體組織評分結果基本一致，而且損傷的可逆性和最初的損傷程度相關。體內眼刺激評分同樣是按照角膜、結膜和虹膜損傷權重依次降低的關系建立評價方案，這一原理是開發和驗證眼刺激替代方法的基礎。根據實驗體系的不同，目前建立的眼刺激作用替代模型可概括為細胞功能模型、類器官模型、重建人角膜模型和離體器官模型4類［1］。

2 眼刺激實驗替代方法的標準化

2.1 離體器官替代方法

牛角膜混濁和滲透性實驗（bovine corneal opacity and permeability，BCOP）是2009年被 OECD指南437認可的一種離體器官方法。牛角膜取自屠宰場廢棄牛眼，將角膜固定于特制挾持器提供的正常生理環境中，角膜分隔夾持器為前后兩室，將被測物作用于前室角膜上皮表面一段時間后，通過光濁度儀檢測角膜混濁度及滲透性，評價被測物的眼刺激作用，結合角膜組織病理檢測結果判斷更準確?；谙嗤脑?，利用離體豬角膜開發了PCOP（porcine corneal opacity and permeability）方法［2］。目前認為BCOP低估了受試物對虹膜和結膜的刺激作用，因而適于區分中等到重度眼刺激性物質，對于輕度及以下刺激物區分不夠敏感（表1）。BCOP適用于不同物理性狀和溶解性差異較大的液體和固體受試物，如表面活性劑原料和配方、個人護理用品和其它化妝品，也適用于化學品、藥品和農藥的眼刺激分類［3］。

離體雞眼實驗（isolated chicken eye test，ICE）是2009年被OECD指南438認可的一種替代方法，利用短期離體培養的雞眼球進行眼刺激檢測。取雞眼球固定于夾持器，暴露受試物，通過肉眼檢查、測量角膜厚度、表面灌流和熒光素滲透評價角膜損傷程度。以角膜水腫、透光值和熒光素滯留的數值作為毒理學終點，以平均最大分值計算刺激指數，對眼刺激物的嚴重程度進行分類，結合組織病理檢測有助于結果的準確判斷。ICE實驗的陽性結果可直接用于眼腐蝕性和嚴重刺激性分類，陰性結果不能作為區分刺激物和非刺激物的確認試驗，需補充其它體外方法。適用于 ICE檢測的化學物多為可溶性液體，如表面活性劑和凝膠，對固體物質的測試效果不理想［1］。

離體兔眼實驗（isolated rabbit eye test，IRE）是從人道處死的實驗兔分離完整眼球，固定于特定容器中，保持溫濕度的同時，通過受試物與離體兔眼球的直接作用，檢測角膜透光值（角膜通透性）和厚度（角膜腫脹）程度評價受試物眼刺激性。通過不同暴露時間和觀察指標的組合分析可對受試物的總體損傷做出評估。通常導致角膜水腫超過15％的化學物可認為具有嚴重眼刺激性。目前認為IRE實驗主要用于預測角膜損傷，不能用于評估受試物對結膜的作用或角膜損傷后的恢復作用。適用檢測中等到嚴重程度的刺激性物質，結合角膜組織學檢查可提高預測能力。該方法對堿性物質、陰離子和陽離子表面活性劑、化妝品成分和化學物質較敏感，對固體物質不敏感［4］。

2.2 類器官替代方法

雞胚絨毛膜尿囊膜實驗（HET-CAM）是利用雞胚絨毛膜尿囊膜結構與人結膜相似的特點開發的替代方法，HET-CAM試驗主要測定3種反應，即出血、血管溶解和凝血，受試物直接接觸CAM膜，于5 min內評價上述三種指標的發生情況。預測模型可采用反應時間法（即測定每一種反應終點出現的時間）或刺激閾值法（即測定導致上述毒性終點發生的受試物濃度）。HET-CAM實驗的結果觀察易受操作者主觀因素影響，難以量化，改進后的絨毛膜尿囊膜苔盼藍染色試驗（chicken chorioallantoic membrane-trypan blue staining，CAM-TB），通過測定CAM吸收臺盼藍的量來檢測受試物損傷作用，提高了實驗的重復性。HET-CAM主要適用于無刺激到輕度刺激物的預測或篩選，對中度以上的刺激物應補充其它實驗確認。適合HET-CAM檢測的化合物包括多種類型液體原料和產品，特別適用于表面活性劑和表面活性劑配方。對固體、不溶性或粘稠物質的測試重復性較差，色素和染料測試應慎重［5］。

絨毛 膜 尿 囊 膜 血 管 試 驗 （chorioallantoic membrane vascular assay，CAMVA）試驗是簡化了的HET-CAM方法，只觀察受試物暴露CAM 30 min后血管的變化（出血、血管溶解和凝血），計算使50％的雞胚出現上述損傷的受試物濃度。CAMVA法適用于輕度到中度眼刺激性化合物的檢測，也可正確區分刺激物和非刺激物，但不能用于嚴重刺激性物質的分類。適于檢測物質的類型同 HETCAM法［1］。

蛞蝓粘膜刺激實驗（slugmucosal irritation，SMI）以低等生物蛞蝓作為受試材料，利用其體表粘膜受到刺激后會釋放粘液和分泌物的特點模擬眼球結膜和角膜的功能，通過對分泌的粘液量、乳酸脫氫酶、蛋白質和堿性磷酸鹽的測定評估被測物的刺激性。該方法可以區分無刺激和刺激性物質，適用于檢測表面活性劑、酯、醇、酮及混合物，以及黏性粉狀配方的安全評價。

2.3 重組人角膜組織模型（human corneal epitheliummodels，HCE）

EpiOcular模型是美國MatTek公司生產，由來源于正常人的表皮角質細胞生長于嵌入式細胞培養板以無血清培養基制備而成，細胞分化形成的多層結構與角膜上皮相似。EpiOcular試驗的測試終點主要是MTT檢測得到ET50（組織活性降低50％的有效暴露時間），還包括IL-1a、PGE2、LDH和鈉熒光素滲透性檢測。SkinEthicTMHCE模型由法國SkinEthic實驗室開發，在聚碳酸酯膜上按種人角膜上皮細胞（HCT細胞系），氣-液界面培養形成由多層上皮細胞組成的與人眼角膜粘膜類似的重建組織。角膜上皮短時接觸被測物后，采用MTT法或LDH釋放測定組織活性，或測定細胞因子（例如，IL-1a、IL-6、IL-8、PGE2）定量釋放和基因表達，標準化測試指標是ET50。這兩種角膜模型已商品化供應［6-7］。

HCE模型適用于檢測輕微到中度范圍內的眼刺激物，還可用于區分高中度和嚴重刺激物。適用于各類物理性質的化合物測試，在化妝品工業中，用于確定受試物的毒性限量（如測定輕微作用水平劑量），或用于產品配方階段的臨床前安全性試驗，以及用于配方比較和優化等（表1）。

2.4 基于細胞功能的替代方法

中性紅攝取（NRU）或釋放（NRR）試驗：利用活細胞能攝取中性紅染料的特性，可開發基于中性紅染料攝取或釋放的檢測方法，前者是先將細胞與受試物作用，通過定量測定染料的攝取量反應細胞的活性；后者是先將活細胞用染料負載后再與受試物作用，通過死亡細胞釋放出的染料間接反應細胞的活性。多種原代細胞和細胞系均可用于實驗，如中國倉鼠V79、CHO、3T3 Balb/c和兔角膜細胞（SIRC系）。NRU在549nm下測定終溶液的光密度值，通過劑量-反應曲線得到IC50（使細胞中性紅攝取能力下降50％的受試物濃度）。NRR在540nm處測定終溶液的光密度，通過劑量反應曲線計算NRR50（使細胞中性紅釋放下降50％的受試物濃度）。兩個實驗的終點均容易測量，操作簡單、快速、重復性好，可以定量評估化合物潛在的角膜損傷能力。適用于溫和眼刺激性物質的篩查，適用于大多數液體溶解性物質，特別是表面活性劑。但不合適微溶、高揮發性、有色物質或固體物質的測試［1］。

紅細胞溶血實驗（red blood cell haemolysis test，RBC）采用化合物與哺乳動物紅細胞直接接觸，通過定量檢測紅細胞溶血，以及釋放出細胞外的血紅蛋白變性程度，模擬角膜的損傷作用。與其他細胞實驗和商品化角膜模型相比，RBC實驗成本低廉且快速，與HET-CAM實驗相關性良好，適用于區分極輕度和非輕度刺激物，特別是潛在急性眼刺激性物質的快速篩查。檢測物質類型包括表面活性劑及相關產品［8］。

熒光素漏出實驗（fluorescein leakage，FL）采用單層上皮細胞培養形成的緊密連接模擬角膜上皮細胞的屏障功能，通過檢測緊密連接和橋粒受損后發生的熒光素漏出量，判斷化合物是否具有眼刺激性。被測物濃度引起20％的熒光素漏出（FL20）的值可用于評估被測物潛在眼刺激性。FL實驗適用檢測輕度到中等眼刺激性物質，適合于表面活性劑及相關物質、醇的檢測［1］。

細胞傳感器實驗（silicon Microphysiometer，SM）是基于細胞代謝活性改變的實驗。培養的細胞會釋放酸性代謝物，使培養基pH值下降，進而引發硅膜感受器表面電位改變，試驗前先檢測細胞基礎代謝率，然后不斷逐漸增加被測物濃度，通過間接測量細胞外pH值的變化檢測代謝率的改變。計算MRD50（使細胞代謝率減少50％的受試物劑量）判斷被測物的潛在眼刺激性。SM已通過ECVAM的三期驗證，常用于至上而下的眼刺激組合策略的一部分，用于檢測腐蝕性和嚴重眼刺激性化合物。適用于水溶性化合物的測試（表1）。

表1 眼刺激替代方法Tab.1 Alternativemethods to eye irritation

3 眼刺激實驗替代方法展望

3.1 現有方法的優化和標準化

除了法規認可的4項標準化替代方法外，多數方法處于前驗證研究階段，其中重建人工角膜模型是最具前景的替代方法。基于體外皮膚模型已于2010年被OECD認可為替代皮膚刺激試驗的標準檢測方法，角膜模型有望2年內通過驗證?，F有的2種模型分別是來自歐洲 SkinEthic公司和美國MatTek公司，兩者所用細胞來源不同，因此需要優化方法和統一SOP，還需要增加檢測終點以提高預測能力，如對屏障功能的影響有助于區分非刺激性和輕微刺激性物質［6-7］。

3.2 新替代方法的研發

現有體外方法不能預測化合物對組織修復能力的損傷，也無法檢測組織損傷后的修復能力，新方法的研發基于以下幾點：①離體角膜維持培養模型，觀察化學物暴露后角膜的損傷及修復，研究離體角膜生理動力學功能改變和損傷后信號的釋放用于預測化學物眼損傷及修復機制［9］；②建立含上皮、基質和內皮的多層角膜模型，以了解化合物對角膜損傷程度和修復質量的預測，體外重建結膜模型也是重要方向；③運用基因組學技術，采用模式識別等方法建立反映角膜損傷和修復的新終點。

3.3 非生物預測模型

由于眼刺激生物學機制的復雜性，建立計算機模型非常困難，現有模型多數是對眼刺激生理學作用的模擬，如滲透作用或腐蝕性。這些模型包括：經典的定量模型；分類模型；分子-膜相互作用模型；采用非線性QSAR技術的神經網絡模型和專家系統（如TOPKAT、BfR的風險決策樹）。其中德國風險評估研究所開發的決策支持系統已進入ECVAM的驗證程序［10］。另外一項可用于眼刺激替代方法研究的是毒理學相關閾值法（TTC），它建立在對現有大量化學物質毒性資料分析的基礎上，利用大多數已知化學物的暴露閾值，評估類似新物質的危害，但用于眼刺激的研究還不多見。

4 體外方法分層組合策略

將現有的不同預測能力和適用范圍的體外方法組合建立整合策略，是替代眼刺激動物實驗的理想模式［11-12］，即使今后有新的方法開發和通過驗證，也只能是減少組合的方法數量和提高整合方法的預測能力。不同方法的組合應建立在對現有方法的技術原理和適用范圍科學分析的基礎上，并應考慮：①建立科學合理的化妝品眼刺激替代的整合策略；②整合方法如何用于風險評估和安全評價；③整合方法的科學性如何驗證；④對不同劑型的化妝品原料和產品進行逐類分析，如乳液類、彩妝類、粉餅類、膏霜類等；⑤考慮化妝品以外的其它化合物或新物質的評價，如農藥、納米材料、醫療器械等［12-13］。

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