短端粒小鼠與正常小鼠間充質干細胞的分離培養比較

宋 舸，張俊伶，鞠振宇

（1.中國醫學科學院，北京協和醫學院，醫學實驗動物研究所，衛生部人類疾病比較醫學重點實驗室，國家中醫藥管理局人類疾病動物模型三級實驗室，北京 100021；2.中國醫學科學院放射醫學研究所天津市分子核醫學重點實驗室，天津 300192）

實驗小鼠作為研究間充質干細胞（MSC）功能的載體發揮著重要作用，傳統獲取小鼠MSC方法主要來自骨髓，利用MSC細胞具有在塑料培養皿上貼壁的特點得到。但是因為小鼠骨髓的MSC數量很少，并且有造血細胞的污染，常給研究帶來不少不確定因素。此后不斷對此方法進行改進，如通過磁珠分選、逆轉錄病毒轉染等，然而仍舊存在不易標準化，并且有或多或少損傷細胞生物學特性的問題。因此，受到有關人體骨片中獲得MSC的方法的啟發［1］，我們嘗試通過培養小鼠的下肢皮質微粒骨，同時也由于皮質骨中造血細胞污染機會很少，希望建立獲得小鼠MSC簡便穩定的方法。

端粒是真核細胞染色體末端的一種保護性結構，在維持染色體末端穩定性等方面起重要作用。端粒被認為是細胞衰老的生物鐘。研究證明端粒的長度隨著人體的衰老呈進行性縮短，端粒的長度與許多衰老相關的疾病密切相關。骨質疏松作為一種與衰老相關的疾病，也與染色體末端端粒功能的異常相關［2］。研究衰老模型的 Terc-/-鼠，經過連續傳代到第三代（G3），其端粒長度與人接近，而且它的骨骼畸形、骨質疏松的表型也更加容易觀察，因此本實驗以WT鼠和Terc-/-鼠G3為研究對象，通過體外細胞培養建立獲取MSC的方法，初步比較它們的生物學特征，為今后深入研究其各項功能提供技術支持。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

WT鼠和Terc-/-鼠的飼養和使用符合中國醫學科學院實驗動物研究所標準。研究使用的小鼠均為G3代，WT為對照。分別取2月齡和9月齡鼠各5只，所用的動物遺傳背景為 C57BL/6。WT鼠購自中國人民解放軍軍事醫學科學院實驗動物中心［SCXK（軍）2007-004］。

1.2 小鼠皮質骨MSC的分離

小鼠脫頸處死后，浸泡在70％酒精中2 m in，轉入100 mm無菌平皿，切開下肢皮膚，顯微剪刀盡可能分離干凈附著在股骨和脛骨上的肌肉、韌帶，將骨組織放入無菌紗網布上，搓去殘留的肌肉和韌帶。將骨組織置入35 mm無菌平皿中，加入5 m l培養液（α-MEM+1％P/S+2％FBS），為保持MSC細胞活性，操作不易超過2 h。剪去骨兩端的骨骺以便沖洗髓腔內的造血細胞，沖洗至髓腔變白。將骨組織剪成1～3 mm2大小顆粒，轉至25 cm2平皿中，加入3 mLα-MEM（含1 mg/mL膠原酶Ⅱ），在37℃振搖1～2 h。回收消化松散的骨片準備原代培養。

1.3 小鼠皮質骨MSC的原代培養

將經上述分離所得的骨片種于25 cm2平皿中，加入6 m Lα-MEM（含10％FBS及1％P/S），在37℃，5％CO2條件下連續培養3 d，此間避免不必要的晃動干擾。3 d后更換培養液，棄未黏附的細胞，加入6 m Lα-MEM（含10％FBS及1％P/S）繼續培養2 d。培養5 d后，棄培養液，加入3 m L 0.25％胰酶+0.02％EDTA（室溫）消化3 m in，回收細胞。骨片仍用于繼續獲得MSC細胞，方法同前。MSC細胞按每孔細胞1×104個CM2的密度接種于6孔培養板內，加入α-MEM（含10％FBS及1％P/S）培養液，于37℃，5％CO2條件下培養；接種3 d后進行第1次換液，以后隔日換液。每天隨機抽取3只實驗動物的MSC作細胞生長動力學觀察，直至貼壁細胞鋪滿整個培養孔的底部。

1.4 小鼠皮質骨MSC的傳代培養及 MSC的增殖分析

原代培養一旦鋪滿整個培養孔的表面，即可用0.25％胰酶+0.02％EDTA液消化分離（18～25℃，3 min）貼壁細胞，傳代接種培養的比例1∶3，標記為P1，隔日換液，至貼壁細胞鋪滿培養孔的底面。再重復以上操作，進行下一代傳代接種培養，標記為P2，余類推。抽取3只實驗動物MSC由P1代開始，逐代進行傳代培養，直至培養細胞出現衰老征象，停止傳代培養。以細胞群體倍增值（population doublings，PDs）［3］作為分析動物 MSC的自我更新能力的指標，PDs=lg（培養后細胞計數/培養前細胞計數）/lg2。各代PDs值累加即得最終的累積細胞群體 倍 增 值 （cumulative population doublings，CPDs）。

1.5 數據統計分析

采用SPSS16.0軟件，將2月齡和9月齡WT鼠和Terc-/-鼠MSC的傳代生長克隆數取均數，進行計量資料的T檢驗比較。

2 結果

2.1 MSC原代培養的生長特征

WT鼠MSC原代培養生長顯示，原代接種后的48 h開始從骨片遷出并貼壁，其后24 h可見大量細胞游出在骨片邊緣，貼壁生長細胞外形為紡錘型或梭形，3 d為MSC生長的潛伏期，此期主要為MSC的貼壁生長階段，培養細胞的有絲分裂活動不甚活躍；第4～6天開始，相差顯微鏡下可以觀察到貼壁細胞已形成大小不一的多個細胞克隆，說明此時細胞的有絲分裂活動開始變得活躍起來（圖1）；第7～8天這些細胞克隆進一步擴大，許多細胞克隆彼此相連，細胞生長曲線顯示此階段細胞數目呈指數級遞增，此期為MSC原代培養生長的對數增殖期；第9～11天，細胞克隆彼此相連并鋪滿整個培養孔底面的大部分，細胞生長曲線顯示MSC生長進入一個平臺期；隨后貼壁生長的MSC開始鋪滿整個培養孔底面，原代培養結束。通過比較2月齡和9月齡WT鼠和Terc-/-鼠 MSC的原代生長特征，Terc-/-鼠的MSC生長緩慢，形成克隆數量少，原代細胞形成克隆數為WT鼠＞Terc-/-鼠。

圖1 接種4 d后MSC形態鏡下觀察Fig.1 Morphology of MHCs observed by microscope

2.2 MSC傳代培養的生長特征

WT鼠MSC傳代培養多數于P9代以后開始出現衰老征象。傳代細胞的生長較原代要快些，多于接種后10 d即可鋪滿整個培養孔的底面。對2月齡和9月齡WT鼠和Terc-/-鼠傳代細胞培養觀察比較，以鏡下大于10個細胞的計為一個集落（圖2，P＜0.01）。傳代培養潛伏期約為24～36 h；傳代培養對數增殖期約為4～6 d；對數增殖期結束后至接種后第10天，MSC生長逐漸緩慢，進入平臺期。

2.3 MSC自我更新能力分析

隨著傳代培養代數的漸次增加，MSC的生長速度有逐漸緩慢的趨勢。傳代接種第5天后，Terc-/-鼠P4以后的MSC生長速度減緩明顯，至接種后第10天計算所得的MSC數目WT鼠＞Terc-/-鼠。三種不同基因型鼠各隨機抽取的3個樣本，傳代培養觀察發現出現衰老征象的情況分別是：WT鼠于P10，Terc-/-鼠于 P7，故統計 MSC的 PDs及 CPDs計算至P7。由圖3可見，從P1至P8每代MSC的

圖2 小鼠MSC的P2傳代細胞培養生長情況Fig.2 Culture status on passage 2 cells of MSC from mice

PDs值在P3達到高峰，而P7之后則僅為不足1，說明增殖能力減弱；WT鼠的CPDs值為10.4±1.1，明顯高于Terc-/-鼠，在P1至P7階段的體外培養分離中，MSC的有絲分裂活動旺盛，具有活躍的增殖倍增能力。

圖3 兩種小鼠MSC傳代培養的CPDL變化比較Fig.3 Cumulative population doublings＇difference between two type mice

3 討論

間充質干細胞多來自骨髓，也存在于其它器官和組織［4］，一定條件下MSC可以分化成多種組織，包括骨，脂肪和軟骨。MSC的功能除了促進造血和組織修復外，更多的應用在疾病治療方面，如骨骼缺損，糖尿病，急性移植排斥反應和類風濕關節炎等。為實現上述臨床應用研究，以小鼠為研究對象進行了大量的實驗研究，如何從小鼠提取足夠多的MSC成為關鍵。

小鼠 MSC分離培養方法起初由 Friedenstein等［5］建立，利用MSC具有能粘貼在塑料培養瓶的特性分離MSC，利用該方法從人類和大動物骨髓中分離獲得MSC比較成功，但在小鼠骨髓內獲得足夠多的MSC相對困難，因為小鼠的骨髓腔內MSC數量低，同時也存在造血細胞的污染。為了改進這這一方法，有研究嘗試使用磁珠分選、逆轉錄轉染和建立獨特培養體系等方法［6，7］，但是這些方法標準化困難，并且或多或少損傷細胞生物活性。

細胞生物學原理顯示細胞的數量及密度對其增生和分化會產生很大的影響，由于小鼠MSC在骨髓中所占的細胞比例少，因此設法改進在體外條件下提取純化更多MSC成為實驗的重點。本實驗以小鼠皮質骨微小骨片獲得鼠MSC的培養方法，獲得了大量的MSC，方法簡單且重復性好。相同的獲取MSC的方法見于人體松質骨骨片［8］。與從小鼠股骨骨髓腔獲得 MSC不同，本方法通過多次沖洗髓腔，力求徹底減少造血等細胞的污染，將皮質骨切成微小骨塊酶消化后置于培養液內，開始3 d內不需要換培養液，48 h可見骨片周圍有成纖維樣細胞，72 h可以觀察到克隆形成，優于骨髓腔來源的MSC培養觀察。這種方法可以在較短時間內獲得大量（數量＞107）MSC細胞，并且培養過程中不需要額外添加細胞生長因子，渴望為今后實驗研究小鼠MSC提供比較好的技術支撐。

端粒是位于真核細胞染色體末端的帽狀結構，主要功能是穩定染色體，保護DNA。正常細胞每分裂一次，端粒都會縮短。端粒縮短限制了細胞的壽命，在衰老和慢性病過程中細胞的增殖能力下降，當端粒縮短到一定程度，染色體末端脫帽導致細胞衰老或凋亡。因為WT鼠的端粒長度是人類的五倍，所以建立3～6代以后的鼠，這時的端粒才會足夠短，表型也容易觀察［9］。通過建立觀察端粒酶基因敲除鼠 G3（Terc-/-鼠第三代）的表型，發現Terc-/-鼠存在造血功能、成骨能力以及消化系統的明顯衰老，骨骼器官的衰老主要原因可能來自MSC的功能異常，經過原代和傳代培養觀察，Terc-/-鼠MSC的增殖能力明顯低于WT鼠。通過對MSC連續傳代培養，結果顯示，Terc-/-鼠MSC在經歷了7代的傳代培養以后MSC出現衰老征象，即細胞增生速度緩慢，多數細胞出現核固縮、核碎裂及由培養孔底面脫落等，這與許多其他種類細胞的體外傳代培養的結局相似。因此有關這種衰老現象出現的機理有待于通過進一步實驗闡明。此外，與原代培養生長曲線相比，傳代細胞的生長潛伏期較短，每代鋪滿培養孔底面需要時間短于原代細胞，這種共性見于WT鼠和Terc-/-鼠。

組織發生生物學認為，MSC可以向所有的中胚層起源的組織細胞方向進行分化，這是涉及諸多機制和階段的復雜過程［10］。已有報道通過MSC來修復骨組織、關節軟骨組織的缺損大都建立在大動物基礎上，如兔，羊，犬等，這些大動物骨髓內的 MSC數量雖然較多，能滿足研究需要，但是面對日益復雜的疾病模型研究，大動物無法提供靈活而豐富的基因型，小鼠則具有這一優勢，這無疑為MSC研究提供更佳選擇。現在，我們成功建立小鼠的MSC體外分離培養方法，初步觀察對比 G3WT鼠和G3Terc-/-鼠的MSC生長和增殖特征，以此為基礎，為我們今后深入研究MSC的各項功能提供啟發和指導。

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［10］趙春華 主編.干細胞原理、技術與臨床.北京：化學工業出版社，2006.63-68.