早期戒煙大鼠肺病理及炎性介質(zhì)變化

姜洪芳，蔡存?zhèn)ィw 立

（1.中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院老年病科，沈陽(yáng) 110004； 2.遼寧省腫瘤醫(yī)院病理科，沈陽(yáng) 110042；3.中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院呼吸內(nèi)科，沈陽(yáng) 110004）

吸煙可誘發(fā)肺部炎癥反應(yīng)，是慢性支氣管炎、肺氣病等疾病的重要致病因素［1］。但目前有報(bào)道稱，戒煙并不能緩解氣道炎癥，尤其是在肺氣腫病情形成以后［2-3］。這將引發(fā)人們思索，是否某些“健康”吸煙者在戒煙后，其病情轉(zhuǎn)歸并不如我們所預(yù)期的樂(lè)觀。鑒于此，我們的研究以早期戒煙大鼠為研究對(duì)象，觀察其戒煙后肺組織病理及炎癥介質(zhì)變化，以期對(duì)戒煙人群做出正確指導(dǎo)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組：實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選用Wistar雄性大鼠80只，體重150～230 g，由中國(guó)醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心提供（SCXK［軍］2007-004），隨機(jī)分為對(duì)照組及早期戒煙0天、1周、2周、4周、6周、8周、12周組，每組均10

只。各組飼料、飲水相同，均予自由飲水和攝食。

1.1.2 早期戒煙組模型制備：將吸煙組大鼠以120只/m3密度放入100 cm ×50cm ×50 cm的有機(jī)玻璃制成的染毒箱內(nèi)。每天被動(dòng)吸煙2次，每次10支，每次間隔4 h，每次30 min，連續(xù)吸煙30 d后戒煙。香煙為沈陽(yáng)卷煙廠生產(chǎn)的藍(lán)翎牌香煙，焦油量：14 mg、煙氣煙堿量：12 mg、烤煙型84 mm。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法：

1.2.1 血清 IL-8濃度的測(cè)定：各組大鼠分別于實(shí)驗(yàn)結(jié)束次日，以2％戊巴比妥鈉（50 mg/噸）腹腔注射麻醉后，腹主動(dòng)脈放血致死。血樣以3500 r/m in離心，取血清，-80℃凍存。采用酶聯(lián)免疫吸附方法測(cè)定血清中 IL-8的蛋白質(zhì)含量。試劑盒購(gòu)于美國(guó)BioSource Europe S-A公司。

1.2.2 NF-κBp65的表達(dá)：取相同部位肺組織，4％多聚甲醛常規(guī)灌注固定、蠟塊制作，切片，貼片。采用S-P免疫組化學(xué)方法，試劑盒購(gòu)于武漢博士德生物工程有限公司。每張切片于光鏡下隨機(jī)選取10個(gè)視野，利用美國(guó) Universal Imaging Porporation圖像分析系統(tǒng)，應(yīng)用Meta Morph軟件，測(cè)定平均光密度值以表示陽(yáng)性產(chǎn)物的強(qiáng)度。

1.2.3 病理學(xué)觀察：各組大鼠均取左側(cè)支氣管旁肺組織，光鏡觀察HE染色切片，按文獻(xiàn)［4］所述方法對(duì)各組大鼠氣道炎癥進(jìn)行病理學(xué)評(píng)分。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：

2 結(jié)果

2.1 早期戒煙組大鼠肺組織標(biāo)本HE染色切片

光鏡下觀察，多數(shù)大鼠可見(jiàn)氣道上皮細(xì)胞纖毛發(fā)生粘連、倒伏，上皮細(xì)胞空泡變形、壞死、增生，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。

2.2 對(duì)照組及早期戒煙組血清 IL-8濃度、肺組織NF-κB的表達(dá)、肺組織病理評(píng)分變化及比較結(jié)果

見(jiàn)表1及彩插1圖1（肺組織HE染色）、彩插1圖2（肺組織NF-κB的表達(dá)）。

表1 對(duì)照組及早期戒煙組血清IL-8濃度、肺組織NF-κB的表達(dá)、病理評(píng)分變化及比較Tab.1 Changes and comparison among control group and early quitting smoke groups in serum level of IL-8，lung tissue expression of NF-κB and pathological score

早期戒煙組大鼠血清IL-8濃度、肺組織NF-κB的表達(dá)及氣道炎癥病理評(píng)分在戒煙后各時(shí)相點(diǎn)較未吸煙對(duì)照組明顯升高，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。早期戒煙組大鼠血清IL-8的濃度、肺組織NF-κB的表達(dá)及肺組織病理炎癥評(píng)分在戒煙后略有上升、且在戒煙后8周達(dá)到高峰，但隨后在戒煙12周時(shí)可見(jiàn)IL-8的濃度有下降趨勢(shì)，肺組織病理炎癥反應(yīng)有所減輕。

3 討論

吸煙誘發(fā)的肺部炎癥反應(yīng)機(jī)制復(fù)雜。在吸煙者中可發(fā)展為有明顯癥狀的COPD患者占15％～20％，有慢性呼吸道癥狀而無(wú)氣流受限者占50％，約30％的吸煙者無(wú)慢性呼吸道癥狀及氣流受限，即所謂的“正常吸煙者”［5］。既往的研究多是以前兩者為研究對(duì)象，其研究結(jié)果已告訴我們，通過(guò)單純戒煙，并不能逆轉(zhuǎn)COPD病情。因此，本研究通過(guò)觀察及檢測(cè)早期戒煙大鼠戒煙后不同時(shí)相肺組織病理及炎性介質(zhì)的表達(dá)，探討“正常吸煙者”在戒煙后病情能否繼續(xù)發(fā)展，與吸煙合并COPD者間戒煙后肺組織病理和炎癥反應(yīng)變化是否一致，關(guān)于此類(lèi)研究在國(guó)內(nèi)外尚鮮有報(bào)道。

香煙煙霧中的氧化劑可增加肺泡上皮細(xì)胞粘液的產(chǎn)生，損傷支氣管纖毛功能，增加內(nèi)皮細(xì)胞通透性，從而有利于炎癥細(xì)胞向病變部位滲出［6］。肺泡巨噬細(xì)胞、上皮細(xì)胞在吸煙、細(xì)菌、病毒感染等刺激下釋放 IL-8增加，IL-8可以趨化中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等導(dǎo)致炎癥反應(yīng)的放大。Sarah等［7］發(fā)現(xiàn)吸煙伴肺氣腫的患者肺泡灌洗液中巨噬細(xì)胞釋放IL-8水平較正常人群升高5倍以上，應(yīng)用香煙溶液刺激肺氣腫患者肺泡灌洗液中的巨噬細(xì)胞，其釋放IL-8的增加量也明顯高于健康吸煙組增加量。Nogueraa等［8］研究表明吸煙伴肺氣腫患者支氣管上皮細(xì)胞及痰液細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IL-8水平明顯高于非吸煙健康對(duì)照及吸煙無(wú)肺氣腫組，證明了IL-8是肺氣腫患者氣道內(nèi)的主要炎性介質(zhì)。

近來(lái)的研究提示NF-κB在炎癥刺激后上調(diào)一系列特定的細(xì)胞因子及粘附分子基因的轉(zhuǎn)錄中起重要作用［9］。NF-κB是一具有基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用的DNA結(jié)合蛋白，對(duì)未受刺激的細(xì)胞，NF-κB與其抑制劑IκB相結(jié)合存在于胞漿中，覆蓋了NF-κB的核定位信號(hào)區(qū)，阻滯了NF-κB活化進(jìn)入胞核發(fā)揮作用，所以IκB與NF-κB的解離是NF-κB活化的首要條件。而煙霧刺激作為NF-κB激活的誘導(dǎo)劑，常與IκB的去磷酸化相關(guān)。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)曾證實(shí)急性暴露香煙后可使肺泡巨噬細(xì)胞中NF-κB活性持續(xù)增強(qiáng)，導(dǎo)致IL-8等炎癥介質(zhì)基因及粘附分子基因的過(guò)度表達(dá)，誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞進(jìn)入氣道，而引起炎癥反應(yīng)的持續(xù)［10］，這一機(jī)制可能與肺氣腫氣道炎癥作用機(jī)制相關(guān)。

由于IL-8、NF-κB等細(xì)胞因子是構(gòu)成肺氣腫氣道炎癥的復(fù)雜的炎癥細(xì)胞、細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)的重要組成成份，能相互促進(jìn)，加速局部炎癥的發(fā)生發(fā)展，在肺氣腫發(fā)病中起著十分重要的作用。因此，本實(shí)驗(yàn)在觀察戒煙大鼠肺組織病理變化的同時(shí)，檢測(cè)血清IL-8濃度及肺組織 NF-κB因子表達(dá)。研究結(jié)果表明，與吸煙合并 COPD者不同，早期戒煙大鼠在戒煙早期雖可見(jiàn)炎癥反應(yīng)略有加重，但隨戒煙時(shí)間延長(zhǎng)，仍可見(jiàn)炎癥反應(yīng)有所減輕。

吸煙所致肺部疾病病變過(guò)程十分復(fù)雜，戒煙后肺組織的炎癥介質(zhì)和炎癥細(xì)胞發(fā)揮作用的路徑和機(jī)制還需要深入研究。目前已有報(bào)導(dǎo)提出，COPD患者戒煙后持續(xù)存在的炎癥反應(yīng)可能是一個(gè)綜合性部分維修過(guò)程，炎癥介質(zhì)及炎癥細(xì)胞的增多可能起到運(yùn)輸和消除炎癥反應(yīng)的作用［11］。因此，建議以后的研究應(yīng)該注重于觀察戒煙者更長(zhǎng)時(shí)間炎癥介質(zhì)及肺組織病理變化，進(jìn)一步將炎癥介質(zhì)及炎癥細(xì)胞分類(lèi)，探討其發(fā)揮作用的機(jī)制。

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