轉座子PiggyBac在哺乳動物中的應用

馬元武，張連峰

（中國醫學科學院，北京協和醫學院，醫學實驗動物研究所，衛生部人類疾病比較醫學重點實驗室，國家中醫藥管理局人類疾病動物模型三級實驗室，北京 100021）

轉座元件或轉座子是指宿主基因組內發生基因座位置的改變的遺傳元件。當對轉座子進行基因工程改造，使之攜帶一段外源基因，當在轉座過程中插入基因的內部或是鄰近位置，會對被插入基因造成基因功能的突變或失活，用以研究基因的功能［1］。轉座子一般由轉座酶和轉座酶所識別一段DNA序列 （轉座識別序列）所組成，轉座序列能夠在轉座酶的作用下完成轉座反應。按轉座過程是否經過RNA中間體而分為I型轉座子和II型轉座子。I型轉座子（或稱逆轉座子），需要先被轉錄成RNA，然后在由轉座子編碼的轉座酶的作用下逆轉錄成DNA插入宿主基因組內。II型轉座子 （或稱為DNA轉座子），II型轉座子轉座過程中不經過RNA中間體，在由轉座子編碼轉座酶的作用下，通過復制或直接剪切的方式將轉座子DNA轉座入宿主基因組內（圖1）。

基因工程手段對DNA轉座子進行改造，將轉座子的轉座識別序列和轉座酶相分離，并在轉座序列內插入一段外源感興趣的基因，當在有轉座酶存在的條件下識別兩端的轉座序列介導轉座反應的發生，已 經 應 用 于 黑 腹 果 蠅 （Drosophila melanogaster），線蟲 （Caenorhabditis elegans）等多種模式生物的基因功能研究。雖然人類基因組內存在著大量轉座序列（約45％）［2-3］，但由于進化過程中的累計突變造成其活性喪失，因此，有活性的轉座子在哺乳動物中的應用一直受到限制。直到DNA轉座子Sleeping Beauty（SB）才使得DNA轉座子作為一種遺傳工程工具應用于哺乳動物基因功能的研究。SB來源于鮭魚 （salmanoid）基因組，是一種的Tc1/mariner樣轉座子，Zoltan Ivics等通過分子重建的方式使其重新獲得了活性，并能在人和小鼠細胞內轉座［4］。新型轉座子的逐漸被發現和應用，目前發現在哺乳動物中有活性的轉座子有：1） hAT樣轉座子；2）Tcl樣轉座子包括 Sleeping Beauty和Frog Prince；3）PiggyBac轉座子家族。這三類轉座子中，轉座活性最高的為 Sleeping Beauty和PiggyBac，對這兩種轉座子的特性和轉座活性比較［5］，發現甘藍蠖度尺蛾 （cabbage looper moth Trichoplusia ni）來源的轉座子 PiggyBac相對具有更高的轉座活性，轉座過程中更高的攜帶外源基因插入宿主基因組的能力，并能夠實現轉座子及所攜帶外源基因的完全轉座，不會在供體位置造成任何遺傳物質的改變，這些特性使其在轉基因動物、癌基因發現、iPS研究及基因治療研究方面前景誘人。

1 PiggyBac轉座子

圖1 轉座的分子機制。DNA線性表示，RNA曲線表示Fig.1 Molecular mechanisms of transposition.DNA is represented by straight lines.RNA transcripts are wavy lines

PiggyBac分離于甘藍蠖度尺蛾［6］，最初能夠在果蠅、紅腋斑粉蝶 （red flour beetle Tribolium Castaneum）及昆蟲中轉座，明顯不同于其它已發現的轉座子類型，命名PiggyBac轉座子家族，簡稱PB［7-8］.PB元件是2472bp的轉座子序列擁有13 bp的末端反向重復序列以及編碼594個氨基酸的轉座酶序列組成［9］，識別TTAA序列采用剪切、黏貼的DNA轉座模式（類似于Sleeping Beauty（SB）轉座子）［10］。

PiggyBac樣轉座元件 （PiggyBac-like elements，PLE）普遍存在多物種內，很少具有轉座活性以及完整的轉座子結構，目前成功分離出了如 PBGD（1，3，5）、AyPLE和 AaPLE等多種PLE［11］。經過密碼子優化過的mPB以及hyPB（mPB基礎上的進一步優化獲得具有更高的轉座活性），是目前發現的在哺乳動物中轉座活性最高的 DNA轉座子［5，12-13］。轉座識別序列和轉座酶的分離可以使得轉座子發展為二元系統，見圖1 C。提高了轉座安全性、攜帶外源基因的能力并增強了可操作性。轉座反應需要轉座子序列和轉座酶同時存在。當對轉座識別序列內部插入一段外源基因時，可實現目的基因向宿主基因組的靶向運輸［1］。PB轉座系統作為一種有效的基因工程操作工具由于具有的高容量［14］、無痕跡轉座［9，13］，安全性強等優勢應用在大規模研究基因的插入突變及基因功能研究、癌基因/抑癌基因的發現、iPS研究以及基因治療研究方面。

2 哺乳動物中的應用

在不影響轉座效率的情況下，PB轉座系統可高效攜帶十幾kb外源DNA靶序列轉座，用于靶基因的轉基因研究［12］。此外，當所攜帶的外源基因含有基因捕獲元件時，PB在轉座過程中，可捕獲基因組內基因造成基因的插入突變或失活，通過轉座子的末端重復序列可非常容易定位插入基因的位點，用以研究基因組內大規模基因功能。由于轉座造成基因的插入失活，研究基因與生長，基因與發育，以及基因與基因之間協調作用關系［3，15］。生物體任何功能的行使并不是單個基因所能完成的，他需要多個基因的協同調節表達共同來實現。PB的高轉座效率可造成多個基因功能的喪失，可研究多基因與生長、發育以及基因之間的關系［3，15］。

2.1 基因突變

傳統的基因突變方式主要是通過粒子射線、化學誘變劑以及病毒感染來實現的。雖然這些方法能夠有效的產生突變，獲得感興趣的表型變化，但是后續突變位點的確定卻是費事耗力［16］。幾十年來，由于缺少有效插入突變工具，哺乳動物基因組的大規模遺傳學分析受到了很大的限制［17］。

近年來，DNA轉座子SB和PB的發現和功能重塑，能夠在哺乳動物體內有效轉座，使得這一局面得以改變。DNA轉座子通常由末端重復序列以及位于中間的轉座酶基因構成［1］，轉座反應需要轉座酶識別序列和轉座酶同時存在。轉座酶缺失的轉座元件在有轉座酶瞬時表達的情況下就能夠發生轉座反應。轉座序列和轉座酶可以分離的特性，可構建轉座識別序列和轉座酶相分離的二元轉座系統［15］。在轉座識別序列之間插入我們感興趣的基因 （如功能基因、基因捕獲組件等），當在轉座酶存在下，可以有效的將外源基因運輸進入宿主基因組內。當外源基因為基因捕獲組件時，可以在轉座進入基因組時有效捕獲基因組內基因，實現基因的插入突變或失活。只要存在轉座酶即可以實現轉座，不同于以往的基因打靶方式，這一方法可實現基因組的大規模基因功能遺傳學分析［18］。

2.2 癌基因的發現

癌變的發生是受到遺傳和環境等多種因素影響所致，體細胞基因的突變在腫瘤的發生和發展中起至關重要的作用。在過去的幾十年里，已經應用插入突變的方式在小鼠，大鼠等動物模型中簡單進行癌變的遺傳學分析［19］。然而癌變的發生是一個復雜的過程，正常細胞的癌變可能需要多種突變基因的逐漸積累才能完成。有效基因突變工具的發現和應用對于研究癌變發生的遺傳學因素具有重要的意義。PB轉座子是目前發現的轉座活性最高的DNA轉座子，在轉座時能夠實現轉座子序列的完全剪切和轉座，在供體位置處不留任何轉座痕跡，通過轉座子的末端重復序列，可以通過接頭連接的PCR非常方便的對轉座子在基因組中的插入位點進行定位，基于這些特點，使得PB作為一種非常有潛力的遺傳工程工具，可以應用于哺乳動物大規模篩選癌基因的研究［20］，目前已經構建出多種用于癌基因發現的轉座系統載體如 T2/Onc，T2/Onc2和T2/Onc3等［19，21］，為癌基因的發現提供了基礎。通過對插入位點的確定，可以研究基因組特定位點與腫瘤發生之間的關系［22-23］。

2.3 基因治療與iPS

基因治療，要求目的基因能夠特異、有效的導入靶細胞內，并長時間表達，產生盡量少的毒副作用。目前大部分基因治療都采用病毒載體。然而，病毒載體的構建和準備不僅費時、費力同時也存在許多其它問題，如逆病毒載體 （retroviruses）能夠長效的實現目的基因的表達，但由于偏向于插入常染色體的轉錄起始位點和基因的內含子內，容易造成基因的插入失活，易至癌變［24］；腺病毒載體（adenoviruses）可以將DNA運輸到處于分裂或靜止期的細胞內，由于不插入基因內部，不造成致癌突變，但不能保證目的基因的長效、穩定表達，且易引起宿主的免疫應答［25］；另一類為腺聯病毒載體（adeno-associated viruses），降低了宿主的免疫應答反應穩定的表達，但目的基因的大小卻受到限制［26］。新型的非病毒載體的應用就顯得非常重要。

SB和PB轉座子的發現，使得轉座子作為一種有用的基因工程工具應用于哺乳動物，SB和PB的“剪切-黏貼”的DNA轉座模式，相對低的費用、低的免疫反應性、高的轉座效率、高容量，安全性強等特點［27］，使其在基因治療方面具有非常大的應用潛力。自SB于1997年發現以來，人們一直致力于將其應用于基因治療，并取得了許多可喜的成果，如可以用于小鼠遺傳缺陷造成的基因病的治療研究，如 I型酪氨酸血癥［28］，A型［29］和 B型［30］血友病，亨廷頓病［31］等遺傳型疾病的治療研究。隨著研究的不斷深入，通過對 SB轉座系統引入嵌合體抗原受體來介導T細胞的重定向特異性，已經用于 I/II期臨床試驗［27］。然而，SB的相對較低的轉座活性，以及明顯的供體附近位置轉座偏好性，限制了其在基因治療方面的應用。PB轉座系統的高轉座活性和無痕跡轉座，使得PB成為一種比SB轉座系統具有更廣闊應用前景的DNA轉座子［32-34］。

SB和PB雖然在基因治療方面潛力巨大，但它們的安全性仍是基因治療的所考慮重點，非特異性整合會導致所不期望的后果［35］。這一不足正在通過在轉座酶中嵌合入 DNA結合結構域 （DNA binding domain，DBD）進行彌補，前期的實驗表明，這一改進能有效提高轉座系統的轉座效率和特異性［36-38］。此外，只要有轉座酶的存在就會有轉座的發生，也使得轉座相對不穩定，Johann Urschitz等通過對轉座系統進行改進，獲得了一種不依賴于輔助載體的轉座系統，轉座發生后會造成轉座酶的失活，解決這一問題［39］。

iPS的顯著優勢是具有類似于胚胎干細胞的多潛能性，并且可以用于誘導分化成為內胚層、中胚層和外胚層用以移植來治療退行性或遺傳性疾病［40］。通常情況下，鼠或人的成纖維細胞的重新編程為多潛能干細胞，需要四種轉錄因子 c-Myc，Klf4，Oct4 and Sox2［41］的輔助.以往應用于iPS研究輔助因子的運輸工具主要為病毒載體，但是病毒載體存在著類似于基因治療方面的缺陷，很難排除由于外源基因導入基因組所造成的改變對 iPS的影響。

PB轉座系統在轉座后不留任何足跡，在由 PB轉座系統提供四種轉錄因子 c-Myc，K lf4，Oct4和Sox2完成 iPS后，可以通過提供 PB轉座酶在基因組內消除載體。由于 PB的無痕跡轉座，不會造成遺傳物質的改變，可以用于探索體細胞的重新編程時，消除外源載體因素所可能造成的影響，為iPS的研究提供了有力的工具［39，42-43］。

3 小結

PB轉座子是目前在哺乳動物中轉座活性最高的轉座子，并且可以攜帶高達十幾Kb的外源基因轉座而不影響其效率，使其在哺乳動物的轉基因、癌基因的大規模篩選、基因治療方面具有巨大的應用潛力。此外，PB的無痕跡轉座對產生無轉基因、無遺傳物質改變的iPS研究也具有非常重要的意義和應用前景。然而，轉座子的非特異性轉座，也影響了其在哺乳動物中的應用。因此，DNA轉座子雖然具有誘人的應用前景，但應用的道路卻很漫長。

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