壯陽藥效動物實驗評價方法的改進

曹 瑩，孔煥育，丘玉昌，王杞妹，崔東方，林繼紅

（1.南方醫(yī)科大學(xué)新藥評價中心，廣州 510515；2.南方醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心，廣州 510515）

勃起功能障礙 （erectile dysfunction，ED）是指陰莖持續(xù)（至少6個月）不能達(dá)到和維持充分的勃起以獲得滿意的性生活［1］。在 40～70歲的男性中約有50％的男性有不同程度的ED，ED成為困擾男性的最常見病癥之一。近年來，有關(guān)ED的研究進展十分迅速，基礎(chǔ)研究不斷深入，許多治療手段廣泛開展，尤其是藥物治療的快速發(fā)展［2］。尋求一個簡單有效的壯陽藥效評價方法，對于篩選有效的治療藥物有很大的幫助。現(xiàn)行采用的較為簡單的評價方法主要是通過觀察記錄給藥前后動物性行為活動的改變，計算動物陰莖勃起指數(shù)（penile erection index，PEI）并做出比較，從而對候選藥物的壯陽藥效作出評價［3-5］。但這種方法在實際操作過程中也存在一定的缺陷，一方面，采用傳統(tǒng)的人工觀察需要耗費大量的人力和時間，而且會因為人工操作能力的有限性和動物行為活動的的不可回放性造成部分?jǐn)?shù)據(jù)的丟失；另一方面，部分壯陽藥在沒有性刺激的情況下并不能有效的改善ED，如經(jīng)典壯陽藥西地那非，若在動物性行為活動的觀察期間不給予適宜的性刺激會有可能造成藥物篩選的假陰性。針對這些原因，本實驗對傳統(tǒng)的壯陽藥效評價方法進行了改良，采用攝像頭觀察動物性行為活動并在該過程中給予動物適度的性刺激，并用經(jīng)典壯陽藥西地那非驗證該評價方法的效性。

1 材料和方法

1.1 材料

成年健康SD大鼠，雄性，80只（體重220±10 g），雌性，4只（體重200±10 g），由南方醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供（SCXK［粵］2006-025）。枸櫞酸西地那非片（輝瑞制藥有限公司），特制玻璃大鼠籠及鼠籠架。

1.2 方法

80只雄性SD大鼠隨機分為8組（n=10）：對照A組、對照B組、對照C組、對照D組、模型A組、模型B組、模型 C組、模型 D組。每組10只，分別置于特制的玻璃鼠籠中，自由飲水和攝食，適應(yīng)性飼養(yǎng)2 d后，開始給藥，模型組大鼠均灌胃給予西地那非10 mg/kg，對照組大鼠給予相同容量的生理鹽水灌胃，每天1次，連續(xù)灌胃給藥14 d。每次給藥后連續(xù)記錄2 h內(nèi)動物陰莖勃起、陰部理毛、爬背次數(shù)和每種性行為活動參與的動物數(shù)。

其中，對照A組及模型A組每次給藥后人為觀察大鼠性行為活動（人為觀察組）；對照B組及模型B組每次給藥后于安靜無人環(huán)境下采用攝像頭觀察大鼠性行為活動（攝像頭觀察組）；對照C組及模型C組每次給藥后將一只雌鼠于給藥后0～30 min及90～120 min置于各鼠籠籠蓋上對雄鼠進行性誘導(dǎo)并于安靜無人環(huán)境下采用攝像頭觀察大鼠性行為活動（雌鼠間斷誘導(dǎo)組）；對照D組及模型D組每次給藥后在觀察的全過程（0～120 m in）將一只雌鼠置于各鼠籠籠蓋上對雄鼠進行性誘導(dǎo)并于安靜無人環(huán)境下采用攝像頭觀察大鼠性行為活動（雌鼠持續(xù)誘導(dǎo)組）。

1.3 觀察指標(biāo)：給藥后2hPEI

記錄各組大鼠給藥2 h內(nèi)動物陰莖勃起、陰部理毛、爬背次數(shù)和參與動物數(shù)，計算 PEI值。（PEI =每組大鼠相關(guān)性行為反應(yīng)總次數(shù)×每組中有相關(guān)性行為反應(yīng)的大鼠數(shù)/每組大鼠數(shù)量）

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS13.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行分析，數(shù)據(jù)均采用均數(shù)士標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。組間比較采用t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 給藥后2h各組大鼠PEI值

與對照C組相比，模型C組大鼠給藥后2 h PEI值明顯升高（P＜0.05）；與對照 D組相比，模型 D組大鼠給藥后2 h PEI值明顯升高（P＜0.05）；與模型A組相比，模型B組、模型C組及模型D組大鼠給藥后2 h PEI值明顯升高（P＜0.05）；與模型B組相比，模型C組及模型D組大鼠給藥后2 h PEI值明顯升高（P＜0.05）；而模型D組與模型C組間大鼠給藥后2 h PEI值無顯著性差異。各組大鼠 PEI值見表1。

表1 各組大鼠給藥后2h PEI值的比較Tab.1 Comparasion of 2h PEI after each drug adm inistration

2.2 模型C組及模型D組大鼠給藥后2h內(nèi)各時間段PEI值

模型C組與模型D組給藥后0～60 min時間段內(nèi)PEI值比較無顯著性差異；給藥后60～120 m in時間段內(nèi) PEI值比較有顯著性差異（P＜0.05），模型C組明顯高于模型D組（見表2）。

表2 大鼠給藥后各時間段 PEI值的比較Tab.2 Comparasion of PEI for each time interval

3 討論

目前公認(rèn)的勃起功能障礙的動物模型有去勢建立腎虛模型、動物交配能力模型、重復(fù)應(yīng)激性小鼠性行為低下模型、房勞過度致腎虛模型等［6］。這些模型雖在一定程度上模擬了勃起功能障礙的臨床表現(xiàn)，但操作較為繁瑣、觀察困難并涉及造模成功率的問題，一定程度上影響壯陽藥物篩選的進度。本實驗主要觀察給藥后動物相關(guān)性行為活動情況，通過優(yōu)化觀察過程中的一些影響因素，尋求一個簡單有效的壯陽藥效評價方法。

陰莖勃起的生理機制涉及性刺激過程中陰莖海綿體內(nèi)一氧化氮（NO）的釋放。NO激活鳥苷酸環(huán)化酶導(dǎo)致環(huán)磷酸鳥苷（cGMP）水平增高，使海綿體內(nèi)平滑肌松弛，血液充盈［7］。西地那非能夠通過抑制海綿體內(nèi)分解cGMP的5型磷酸二酯酶（PDE5）來增強NO的作用，對陰莖有很強的勃起作用［8］。西地那非由美國輝瑞公司研制生產(chǎn)，該藥于1998年4月在美國以商品名 Viagra（偉哥）上市，是目前臨床上用于治療勃起功能障礙最有效的藥物之一［9］。因此，本實驗選用西地那非作為陽性藥物來評價壯陽藥效評價方法是否可行。

西地那非作為PDE5抑制劑，能刺激使陰莖海綿體內(nèi)釋放NO，NO活化鳥苷酸環(huán)化酶，使GTP轉(zhuǎn)化為cGMP，并減少cGMP降解，增加海綿體動脈的最大血流速度和平均血流速度，增加血流量，促使陰莖勃起。其對離體陰莖海綿體無直接舒張作用。當(dāng)性刺激引起局部NO釋放時，西地那非抑制PDE5可增加海綿體內(nèi)cGMP水平，海綿體內(nèi)平滑肌松弛，血液流入海綿體。在沒有性刺激時，推薦劑量的西地那非不起作用［10］。實驗結(jié)果顯示，在給予雌鼠誘導(dǎo)性刺激的情況下，大鼠出現(xiàn)較為頻繁的性行為活動，給予西地那非的模型組大鼠更為明顯，同對應(yīng)的對照組大鼠PEI值相比有顯著性差異。在本實驗中，采用了兩組雌鼠誘導(dǎo)方式，一組是于給藥后0～30 min及90～120 min時間段給予雌鼠誘導(dǎo)即間斷誘導(dǎo)，另一組置于觀察的全過程（0～120 min）給予雌鼠誘導(dǎo)即持續(xù)誘導(dǎo)。在給藥后2 h該兩組大鼠PEI值雖無明顯差異，但分兩個時間段（0～60 m in，60～120 min）比較，結(jié)果顯示，0～60 min時間段兩組大鼠PEI值相似，60～120 m in時間段間斷誘導(dǎo)組大鼠PEI值明顯高于持續(xù)誘導(dǎo)組。持續(xù)誘導(dǎo)方式在本實驗中雖沒有造成最終的藥效評價結(jié)果的不同，但在今后的壯陽藥物篩選過程中倘若改變數(shù)據(jù)采集的時間段會對藥效評價會造成一定的影響。因此，在誘導(dǎo)方式的選擇方面推薦采用間斷誘導(dǎo)方式。

此外，本次實驗結(jié)果證實，攝像頭觀察組PEI值明顯高于人為觀察組，差異有顯著性。究其原因，一方面由于鼠科動物對外界刺激反應(yīng)敏感，噪聲能引起內(nèi)分泌功能紊亂和性功能減退。攝像頭觀察可弱化噪聲等外界環(huán)境因素的影響；另一方面，攝像頭觀察可錄制影音資料，影音資料可反復(fù)回放進行數(shù)據(jù)的采集可保證數(shù)據(jù)完整不缺失。

綜上所述，在壯陽藥篩選中，可以選擇在安靜無人環(huán)境下、采用攝像頭觀察雄鼠性行為活動并在部分時間段給予雌鼠間斷誘導(dǎo)性刺激，計算該過程PEI值評價候選藥物的壯陽藥效。

［1］李宏軍.勃起功能障礙的診治進展與共識［J］.中國性科學(xué)，2011，20（1）：4-22.

［2］張石革，孫定人.治療勃起功能障礙藥物的研究與應(yīng)用進展［J］.中國藥房，2001，（1）：50-51.

［3］Benassi-Benelli A，F(xiàn)errari F，Quarantotti BP.Penile erection induced by apomorphine and N-nopropyl-norapomorphine in rats.Arch Int Pharmadyn 1979；242：241-247.

［4］El-Thaher TS，Matalka KZ，Taha HA，et al.Ferula harmonis‘zallouh’and enhancing erectile function in rats：efficacy and toxicity study.Int J Impot Res 2001；13：247-251.

［5］El-Thaher TS，Khatib S，Saleem M，Shnoudeh A，et al.A novel compound JPM8：in vivo penile activity promotion in rats，effect on the relaxation and cGMP/cAMP accumulation in isolated rabbit corpora cavernosa.Int J Impot Res 2002；14：453-461.

［6］潘建春，阿地力江·伊明.勃起功能障礙實驗動物模型的研究進展［J］.新疆醫(yī)科大學(xué)報，2010，33（11）：1290-1292.

［7］Burnett AL.Nitric oxide in the penis：physiology and pathology［J］.JUrol 1997，157：320-324.

［8］Ballard SA，Gingell CJ，Tang K，et al.Effects of sildenafil on the relaxation of human corpus cavernosum tissue in vitro and on the activities of cyclic nucleotide phosphodiesterase isozymes［J］.The Journal of Urology，1998，159（6）：2164-2171.

［9］Goldstein I，Lue TF，Padma-Nathan H，et al.Oral sildenafil in the treatment of erectile dysfunction［J］.N Engl JMed.1998 May 14；338（20）：1397-404.

［10］Moreland RB，Goldstein I，Traish A.Sildenafil，a novel inhibitor of phosphodiesterase type 5 in human corpus cavernosum smooth muscle cells［J］.Life Sci，1998，62（20）：309-318.