環(huán)磷酰胺對(duì)長(zhǎng)爪沙鼠精子畸形的影響

楊 僖，陳耿喆，何秉嘉，梁 坤，梁成結(jié)，魏 蓮

（1.廣州醫(yī)學(xué)院第二臨床學(xué)院，廣州 510182；2.廣州醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心，廣州 510182； 3.廣州醫(yī)學(xué)院公衛(wèi)學(xué)院，廣州 510182）

長(zhǎng)爪沙鼠又稱蒙古沙鼠，主要分布在我國的內(nèi)蒙、河北、陜西、寧夏等草原地帶［1］。具有獨(dú)特的生物學(xué)特性，是國內(nèi)外正在開發(fā)與利用的多能性實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，越來越廣泛地應(yīng)用于生命科學(xué)的研究。由于對(duì)長(zhǎng)爪沙鼠的繁殖和使用起步較晚，目前供應(yīng)長(zhǎng)爪沙鼠的單位僅有少數(shù)幾家。有必要從不同方面對(duì)長(zhǎng)爪沙鼠進(jìn)行研究，為該物種的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物化，資源開發(fā)提供了理論依據(jù)。

環(huán)磷酰胺（cyclophosphamide，CP）是人工合成氮芥類烷化劑，是一種毒性較低，是細(xì)胞周期非特異性廣譜抗腫瘤藥，也是導(dǎo)致生殖細(xì)胞遺傳性損傷的毒作用，對(duì)人白細(xì)胞及血小板也有一定的破壞作用［2］。本實(shí)驗(yàn)用 CP作誘變劑，探討其對(duì)長(zhǎng)爪沙鼠精子的影響，未見報(bào)道。現(xiàn)我們?cè)趯?shí)驗(yàn)室進(jìn)行了該項(xiàng)試驗(yàn)觀察，以期探討出長(zhǎng)爪沙鼠在臨床用藥或毒理研究更多更好相關(guān)數(shù)據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：雄性長(zhǎng)爪沙鼠，體重在52～70 g，由廣州醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供［SCXK（粵） 0007612］。

1.1.2 材料：環(huán)磷酰胺（CP）為江蘇恒瑞股份有限公司產(chǎn)品，批號(hào)為 09090321；伊紅染液及染缸；甲醇；生理鹽水；注射器；抗凝管；消毒用品，2％戊巴比妥鈉（40 mg/kg）；離心管；手術(shù)剪刀；鑷子等。

1.1.3 儀器：離心機(jī)；照相機(jī)為 Canon PC1252；顯微鏡Olympus BHA；電子天平等。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物分組：選用體重在65±5 g的雄性長(zhǎng)爪沙鼠28只，隨機(jī)分為4組，每組7只，設(shè)正常對(duì)照組和CP組（分低、中、高劑量組其劑量分別為20 mg/ kg、30 mg/kg、40 mg/kg）［3］。試驗(yàn)前動(dòng)物觀察一周，記錄食量、體重、外觀體征和行為活動(dòng)。飼養(yǎng)環(huán)境為廣州醫(yī)學(xué)院動(dòng)物中心，室內(nèi)溫度21～24℃，室內(nèi)濕度45％～70％，動(dòng)物自由進(jìn)食及飲水，飼料由廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中心提供。

1.2.2 動(dòng)物處理：CP用生理鹽水溶解，給藥前配制，CP組每日按低、中、高三個(gè)劑量腹腔注射給藥。正常對(duì)照組用等量生理鹽水注射。連續(xù)注射5 d。給藥后，常規(guī)飼養(yǎng)。

1.2.3 動(dòng)物取材：給藥30 d后，每組取5只長(zhǎng)爪沙鼠麻醉處理：分別取出兩側(cè)附睪，置于盛有0.8 m L 0.9％的生理鹽水細(xì)胞培養(yǎng)液中，用眼科剪剪碎附睪組織或鑷子輕輕撕開附睪包膜，徐徐搖動(dòng)附睪組織，靜置5～10 m in，用鑷子將組織碎片取出，裝入離心管，3000轉(zhuǎn)速/m in的離心機(jī)離心 5 m in，去除上清液，留下約0.2 m L液及沉淀物，混勻余液并用加樣器吸取40μL精子懸液，滴在玻片上推片，自然晾干，每只長(zhǎng)爪沙鼠附睪液制片5張，甲醇固定10 m in后再自然晾干，2％的伊紅染色30 m in，蒸餾水沖洗干凈，晾干，顯微鏡下進(jìn)行閱片觀察。

1.2.4 觀察指標(biāo)精子畸形率：在顯微鏡下計(jì)數(shù)，每張片計(jì)數(shù)200條完整精子中出現(xiàn)的畸形的精子數(shù)，每組共計(jì)1000條。從而計(jì)算出各試驗(yàn)組精子畸形率（％）。同時(shí)觀察畸形的類型。

1.2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用spss12.0軟件進(jìn)行處理，所得數(shù)據(jù)均用均數(shù) ±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，統(tǒng)計(jì)方法使用單因素方差分析（onewayANOVA），以a=0.05作為檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 精子畸形率

低、中、高劑量組分別與正常組比較，長(zhǎng)爪沙鼠精子畸形率差異極顯著（P＜0.01）；低、中劑量組分別與高劑量組相比較，長(zhǎng)爪沙鼠精子畸形率差異極顯著（P＜0.01）；低劑量組與中劑量組比較，精子畸形率差異不顯著（P＞0.05）。

從表2數(shù)據(jù)可知，長(zhǎng)爪沙鼠精子受環(huán)磷酰胺影響而產(chǎn)生的畸形類型主要為尾折疊、尾粗細(xì)/長(zhǎng)短/扭曲。

表1 CP對(duì)長(zhǎng)爪沙鼠精子畸形的影響Tab.1 The influence of CP to the abnormalities of Mongolian gerbils＇sperms

表2 環(huán)磷酰胺對(duì)長(zhǎng)爪沙鼠精子畸形類型統(tǒng)計(jì)Tab.2 Statistics of different influential types of CP on Mongolian gerbils＇sperms

2.2 精子顯微鏡下觀察

顯微鏡下觀察大量精子尾部畸形，以尾折疊、尾粗細(xì)/長(zhǎng)短/扭曲為主，尾折疊占比例最多（見彩插1圖1～4）。

3 討論

精子的成熟和正常形態(tài)發(fā)育受多基因控制，人和哺乳動(dòng)物的基因在正常情況下精液中也有部分精子畸形，但在某些生殖毒物的作用下，精子畸形數(shù)量會(huì)大大增加。

在試驗(yàn)各組中，低、中、高劑量組長(zhǎng)爪沙鼠精子畸形率分別和正常組比較，差異均極顯著（P＜0.01），說明環(huán)磷酰胺對(duì)長(zhǎng)爪沙鼠的精子有明顯的致畸影響；低、中劑量分別與高劑量組相比較，長(zhǎng)爪沙鼠精子畸形率差異極顯著（P＜0.01），說明環(huán)磷酰胺用藥不同劑量對(duì)長(zhǎng)爪沙鼠精子致畸率有明顯差異；低劑量組長(zhǎng)爪沙鼠精子畸形率與中劑量組比較，差異不顯著（P＞0.05）。

上述提示，環(huán)磷酰胺對(duì)長(zhǎng)爪沙鼠精子有一定的致畸率。在一定劑量?jī)?nèi)，環(huán)磷酰胺對(duì)長(zhǎng)爪沙鼠的精子致畸率無明顯區(qū)別。當(dāng)環(huán)磷酰胺高于某個(gè)劑量，隨環(huán)磷酰胺用藥劑量越高，對(duì)長(zhǎng)爪沙鼠的精子畸形率越高。具體的CP劑量范圍對(duì)沙鼠精子具體致畸率需要進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

尾折疊畸形類型是環(huán)磷酰胺對(duì)長(zhǎng)爪沙鼠精子的畸形最多的類型，最高占畸形數(shù)的42.30％；尾粗細(xì)/長(zhǎng)短/扭曲類型：是隨著環(huán)磷酰胺劑量的增加，其在畸形數(shù)中所占的比例有所增加，在高劑量組中達(dá)到36.96％，高劑量組有個(gè)別模型組的精子尾扭曲率占其全精子的95％以上；無鉤也是畸形數(shù)較多的類型，但其受環(huán)磷酰胺劑量影響較小；而其他類型如復(fù)合畸形、鉤變短/直、小頭、胖頭等畸形數(shù)目也較多，雙頭這一類型在畸形數(shù)中所占比例最少。綜合來看，環(huán)磷酰胺對(duì)長(zhǎng)爪沙鼠精子尾部影響最大。

本實(shí)驗(yàn)與李鳳文“環(huán)磷酰胺對(duì)小白鼠精子畸形影響的探討”實(shí)驗(yàn)所用的藥品及劑量相同，取材方法相同.分組方法相同，但實(shí)驗(yàn)用的動(dòng)物品種不同，給藥的方式不同：本實(shí)驗(yàn)用長(zhǎng)爪沙鼠，通過腹腔注射給藥；李鳳文實(shí)驗(yàn)是用小白鼠通過灌胃給藥，所得結(jié)果也有差異，異同對(duì)比如下：

1.兩實(shí)驗(yàn)正常組的精子畸形率相差明顯。李鳳文小白鼠實(shí)驗(yàn)顯示：正常組畸形率是1.34％，而本實(shí)驗(yàn)正常組畸形率是28.7％，說明不同品種的動(dòng)物其正常組精子畸形率是有所不同。長(zhǎng)爪沙鼠精子畸形率明顯比小白鼠精子畸形率高。這可能與長(zhǎng)爪沙鼠的品種遺傳有關(guān)，也可能與我們?cè)趯?shí)驗(yàn)操作中引起有關(guān)。但本人認(rèn)為：長(zhǎng)爪沙鼠精子畸形率高，是其品種與遺傳占主要的。長(zhǎng)爪沙鼠精子畸形率高現(xiàn)象與其出生率較低相吻合，也可說明這一點(diǎn)；反之，大小鼠精子畸形率明顯低，而其出生率每胎平均十多只，是長(zhǎng)爪沙鼠出生率的幾倍。當(dāng)然不同品種的鼠出生率與其排卵數(shù)量等因素也有一定的相關(guān)性，這些都有待進(jìn)一步研究。

2.兩實(shí)驗(yàn)顯示：CP都能對(duì)這兩種動(dòng)物的精子起到明顯的致畸作用，但兩實(shí)驗(yàn)提示CP對(duì)各自精子主要畸形類型不同：小白鼠的精子畸形是不定形畸形為主占8.52％，長(zhǎng)爪沙鼠精子主要畸形是尾折疊畸形類型，最高占畸形數(shù)的42.30％。

3.由于兩實(shí)驗(yàn)的給藥方式不同，可能吸收的藥量有所不同；實(shí)驗(yàn)的動(dòng)物不同，對(duì)環(huán)磷酰胺的敏感程度也有所不同，這些有待進(jìn)一步探討。

本實(shí)驗(yàn)研究顯示，高劑量組動(dòng)物模型出現(xiàn)死亡現(xiàn)象。這可能“高劑量”已達(dá)到CP對(duì)長(zhǎng)爪沙鼠致死量附近，這有待進(jìn)一步研究。

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