吸煙2型糖尿病大鼠葡萄糖轉運子4的表達

王曉蕾 時藝珊 鞠 巍

（沈陽醫學院沈洲醫院內分泌科，遼寧 沈陽 110002）

目前，糖尿病和糖尿病前期在中國普通成年人群中高度流行，嚴重危害人民身體健康[1]。2007年中國糖尿病患者人數已達3980萬，預計2025年將達到5930萬[1]。對糖尿病易患因素及其發病機制的研究已經引起學者們的廣泛關注。目前認為，吸煙是導致人群多種疾病發生發展和死亡的重要影響因素。已有研究表明，吸煙與糖尿病（尤其2型糖尿病）的發病有明確關系[2]。本研究通過觀察吸煙2型糖尿病大鼠肌肉組織中葡萄糖轉運子4（glucose transporter 4，GLUT4）的表達情況，分析吸煙對2型糖尿病發病的影響。

表1 第8周及第12周時三組指標比較（±s）

注：1）與8周正常對照組相比，差別有統計學意義，P＜0.05；2）與8周2型糖尿病非吸煙組相比，差別有統計學意義，P＜0.05；3）與8周2型糖尿病吸煙組相比，差別有統計學意義，P＜0.05；4）與12周正常對照組相比，差別有統計學意義，P＜0.05；5）與12周2型糖尿病非吸煙組相比，差別有統計學意義，P＜0.05

2型糖尿病吸煙組12周（n=20）空腹血糖（mmol/L） 5.00±0.02 9.48±0.071） 9.26±0.091） 5.03±0.03 9.22±0.041）4） 11.01±0.111）2）3）4）5）空腹胰島素（mU/L） 8.84±0.27 20.36±3.021） 19.77±2.681） 9.44±1.34 21.13±2.171）4） 25.65±3.531）2）3）4）5）胰島素抵抗指數 2.16±0.04 7.95±0.281） 7.92±1.211） 2.25±0.08 8.04±0.281）4） 12.53±1.561）2）3）4）5）GHbA1c（%） 4.29±0.34 8.01±0.241） 7.85±0.311） 4.76±0.32 8.12±0.421）4） 8.34±0.461）4）TC（mmol/L） 1.08±0.06 1.70±0.071） 1.69±0.121） 1.10±0.06 1.73±0.101）4） 1.79±0.031）4）TG（mmol/L） 0.48±0.05 1.21±0.071） 1.29±0.131） 0.56±0.02 1.31±0.111）4） 1.35±0.091）4）LDL-C（mmol/L） 0.45±0.03 0.76±0.041） 0.72±0.051） 0.48±0.01 0.81±0.041）4） 1.16±0.061）2）3）4）5）HDL-C（mmol/L） 0.98±0.01 0.76±0.06 0.79±0.05 0.86±0.04 0.68±0.051）4） 0.67±0.021）4）指標 正常對照組8周（n=20）2型糖尿病非吸煙組8周（n=20）2型糖尿病吸煙組8周（n=20）正常對照組12周（n=20）2型糖尿病非吸煙組12周（n=20）

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物及分組

取60只Wistar大鼠（購自中國醫科大學），8周齡，雄性，清潔級。體質量130~200g。去除體重差異較大的大鼠，隨機分配為3組。①正常對照組20只。②2型糖尿病非吸煙組20只。③2型糖尿病吸煙組20只。

1.1.2 主要設備及試劑

顆粒飼料（購自中國醫科大學）；高糖高脂飼料（自配）；鏈脲佐菌素（streptoztocin, STZ，美國Sigma公司）；香煙為市售X牌香煙，尼古丁含量1mg/支，焦油含量18mg/支。RNA提取試劑盒、cDNA合成試劑盒及RT-PCR試劑盒（美國Ambion公司）。引物由大連寶生物工程有限公司合成。日立7170全自動生化儀（日本日立公司）；PCR儀（德國Biometra公司）；Chemi Imager 5500凝膠圖像系統（美國Alpha Innotech公司）。

1.2 方法

1.2.1 動物模型建立

①確定胰島素抵抗動物模型：三組大鼠均每籠3~4只，飼養7周，室溫21~26℃，濕度50~60oC，12h光照周期，動物室內每天清掃消毒。正常對照組予普通飼料喂養，2型糖尿病吸煙組及2型糖尿病非吸煙組給予高糖高脂飼料喂養。飲水為純凈水。三組均喂養7周。②小劑量STZ靜脈注射誘導2型糖尿病模型[3]：2型糖尿病吸煙組及2型糖尿病非吸煙組大鼠尾靜脈注射STZ 15 mg/kg（以pH值4.5的0.1 mmol/L枸櫞酸鈉緩沖液配成0.3%濃度），對照組僅注射枸櫞酸鈉緩沖液。三組繼續原飼料喂養1周后檢測血糖及胰島素等指標，根據隨機血糖＞16.7 mmol/L確定2型糖尿病動物模型[4]，2型糖尿病吸煙組及2型糖尿病非吸煙組共40只大鼠均造模成功。③將2型糖尿病吸煙組大鼠20只關進自制“被動吸煙箱”內。箱上方有通風口與外界相通，側壁有與香煙直徑相通的孔，點燃的香煙煙霧由側壁孔擴散至整個箱內。大鼠在此環境中吸煙，每天吸煙2次，兩次間隔4h，每次30min。2型糖尿病非吸煙組及對照組大鼠同時也被關進“吸煙箱”，相同時間，不輸入香煙煙霧。共4周后檢測三組血糖及胰島素等指標進行比較。整個實驗過程中各組大鼠均無死亡。

1.2.2 指標測定

空腹血糖及胰島素、糖化血紅蛋白、血脂檢查均為禁食水12h后尾靜脈采血測定。①血糖測定：第8周、第12周各測一次空腹血糖。②第8周、第12周各測一次空腹胰島素水平。計算胰島素抵抗指數。胰島素抵抗指數=空腹血漿血糖（mmol/L）×空腹血清胰島素（mU/L）/22.5[5]。③第8周、第12周各測一次糖化血紅蛋白（glycated hemoglobin A1c，GHbA1c）。④第8周、第12周各測一次血脂，包括血清總膽固醇（total cholesterol，TC）、甘油三酯（triglyceride，TG）、低密度脂蛋白膽固醇（low density lipoprotein cholesterin，LDL-C）、高密度脂蛋白（high density lipoprotein cholesterin，HDL-C）。

1.2.3 PCR法檢測GLUT4的表達

實驗12周時三組大鼠均處死。①取骨骼肌組織冷凍保存。②應用RNA提取液提取總RNA。按試劑盒說明合成cDNA。③設計GLUT4正向和反向引物：上游5'-GCGTGGGTTTCGTGCTTT-3'，下游5'-GGTAGTTCCCGATGGCTC-3'，擴增產物片斷長度為154 bp。④按試劑盒操作規程進行競爭性RT-PCR反應。采用競爭性引物混合物（primer∶competimer 比例 2∶8），在擴增目標基因的同時擴增rRNA（489 bp）作為內對照。PCR循環擴增條件為94oC預熱3min，94oC變性30s，56oC退火30s，72oC延伸60s。循環30個周期后72oC延伸4min。⑤2%瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙錠染色。紫外燈下觀察, 拍照。應用密度測定系統測定分析電泳帶的密度。

1.3 統計學分析

數據統計應用SPSS17.0軟件對數據進行統計處理，數據以（±s）表示。多組間均數比較采用單因素方差分析，兩組間均數采用T檢驗，單因素相關分析應用Pearson相關分析，P＜0.05有統計學差異。

2 結 果

2.1 第8周2型糖尿病造模成功，2型糖尿病吸煙組及2型糖尿病非吸煙組空腹血糖及胰島素水平、胰島素抵抗指數、GHbA1c、TC、TG、LDL-C均明顯高于對照組，結果有統計學意義，P＜0.05。第12周2型糖尿病吸煙組及2型糖尿病非吸煙組空腹血糖及胰島素水平、胰島素抵抗指數、GHbA1c、TC、TG、LDL-C均明顯高于對照組，HDL-C明顯低于對照組結果有統計學意義，P＜0.05；2型糖尿病吸煙組空腹血糖及胰島素水平、胰島素抵抗指數、LDL-C水平均明顯高于2型糖尿病非吸煙組，結果有統計學意義，P＜0.05（表1）。

2.2 第12周時取三組大鼠骨骼肌組織，PCR法檢測GLUT4表達。2型糖尿病吸煙組及2型糖尿病非吸煙組GLUT4表達均明顯低于對照組，2型糖尿病吸煙組GLUT4表達明顯低于2型糖尿病非吸煙組。2型糖尿病非吸煙組較對照組下調3.4倍，2型糖尿病吸煙組較對照組下調9.8倍，結果有統計學意義，P＜0.05。GLUT4表達與三組胰島素抵抗指數水平呈顯著負相關（相關系數為–0.825，P＜0.01）。（見表2及圖1）。

表2 第12周時三組胰島素抵抗指數及GLUT4比較（±s）

表2 第12周時三組胰島素抵抗指數及GLUT4比較（±s）

注：1）與正常對照組相比，差別有統計學意義，P＜0.05；2）與2型糖尿病非吸煙組相比，差別有統計學意義，P＜0.05

2型糖尿病吸煙組（n=20）胰島素抵抗指數 2.25±0.08 8.04±0.281） 12.53±1.561）2）GLUT4 1.45±0.02 0.43±0.021） 0.15±0.011）2）指標 正常對照組（n=20）2型糖尿病非吸煙組（n=20）

圖1 第12周時三組大鼠骨骼肌組織GLUT4表達比較

3 討 論

世界范圍內，吸煙是人類的一個重要死亡原因[6]。吸煙與腫瘤、心腦血管疾病、糖尿病等疾病發病均有重要關系[7,8]。流行病學調查顯示，戒煙成功可降低人群病死率，但既往吸煙史所帶來的不良影響仍會持續數年，糖尿病患者表現更為突出[8]。

吸煙通過多種機制影響糖尿病的發生發展，包括胰島素抵抗、胰島β細胞損傷等，其中胰島素抵抗為其主要方面[9]，而胰島素抵抗是2型糖尿病的重要發病機制。本研究通過高糖高脂飼料喂養及靜脈注射STZ誘導方法成功制備出2型糖尿病大鼠模型，并通過計算胰島素抵抗指數對其胰島素抵抗程度進行評價。而后將2型糖尿病吸煙組大鼠置于吸煙箱內繼續觀察。研究發現，試驗12周時吸煙2型糖尿病大鼠的空腹血糖及胰島素水平均明顯高于2型糖尿病非吸煙組和對照組，胰島素抵抗指數明顯增高，說明吸煙確實能夠加重胰島素抵抗，促進2型糖尿病的發生發展。

胰島素抵抗主要表現為外周組織對葡萄糖的攝取利用下降。吸煙可通過多種途徑加重胰島素抵抗，包括脂代謝紊亂及肥胖；血管內膜損傷；胰島素受體敏感性受損等[10]。同時，尼古丁還可以通過興奮交感神經系統進而妨礙葡萄糖轉運[10]。葡萄糖轉運能力是葡萄糖利用的關鍵步驟，葡萄糖轉運系統的損傷可以導致胰島素抵抗[11]。本研究中第12周時取三組大鼠骨骼肌組織，PCR法檢測GLUT4表達。2型糖尿病吸煙組及2型糖尿病非吸煙組GLUT4表達均明顯低于對照組，而2型糖尿病吸煙組較2型糖尿病非吸煙組GLUT4表達減低更加明顯，且與三組胰島素抵抗指數水平呈顯著負相關，說明骨骼肌組織中GLUT4的表達與胰島素抵抗及2型糖尿病的發生發展密切相關。GLUT4是一種跨膜轉運蛋白，廣泛分布于對胰島素敏感的骨骼肌、心肌、脂肪及腎小球系膜細胞、入球小動脈平滑肌段的上皮細胞等細胞中[12,13]。研究表明，GLUT4在葡萄糖轉運的過程中起著重要作用[14]，其表達水平與骨骼肌、脂肪組織等的胰島素抵抗情況密切相關，可影響2型糖尿病的發生和發展[15]。而本研究提示，長期吸煙可能通過減低骨骼肌組織中GLUT4的表達水平增加胰島素抵抗，促進2型糖尿病的進展。

通過本試驗研究我們得出結論，吸煙可通過降低骨骼肌GLUT4的表達增加胰島素抵抗，促進2型糖尿病的發生和發展，危害人類健康。因此，我們積極倡導廣泛戒煙，養成良好生活方式，對早期預防2型糖尿病具有積極意義。

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