豬O型口蹄疫病毒溫度敏感突變株部分基因的PCR擴增及序列分析

劉 航，楊曉燕，侯相民，田永強

（蘭州交通大學化學與生物工程學院，甘肅 蘭州 730070）

口蹄疫（foot-and-mouth disease，FMD）是由口蹄疫病毒（foot-and-mouth disease virus，FMDV）感染偶蹄類動物后引起的一種急性、熱性、高度接觸性傳染病[1]。家畜中牛、豬、山羊、綿羊等均為易感動物[2]。FMDV屬于小核糖核酸病毒科口蹄疫病毒屬，主要有 7 個血清型，分別為：A、C、O、SAT1、SAT2、SAT3以及AsiaI型，每個血清型又包含若干個亞型。FMDV血清型眾多，傳染性極強，給世界多個國家造成了嚴重的經濟損失，嚴重影響了世界畜牧業的發展[3]。FMDV基因組由包含大約8 500個核苷酸的單股線狀RNA組成。口蹄疫P1編碼區決定著病毒的抗原性和血清型，是研究分子流行病學、毒株演化關系和基因工程疫苗的基礎[4-6]。筆者根據O型FMDV全基因組序列設計了5對針對目的基因的引物，通過PCR擴增得到目的基因。對豬O型FMDV的強弱毒株基因進行克隆與序列分析，以期進一步擴充我國口蹄疫病毒毒株基因資料庫，為口蹄疫防治提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株 豬O型口蹄疫病毒和IB-RS-2系傳代細胞，為蘭州獸醫研究所傳染病室分離凍存；感受態細胞JM109以及表達載體pMD18-T Vector購自TaKaRa公司。

1.1.2 試 劑 培養細胞的溶液10×DMEN、三抗、10×EDTA、7.5%NaHCO3、Taq Polymerase、AMV 反轉錄酶、RNase Inhibitor、Oligo（dT）18、質粒小提試劑盒以及膠回收試劑盒等均為大連寶生物公司產品。RNA提取試劑盒為Invitrogen公司產品。其他常規試劑均為實驗室分析純試劑。

1.2 方法

1.2.1 IB-RS-2系傳代細胞的復蘇與病毒傳代將實驗室凍存的IB-RS-2系傳代細胞從液氮中取出，并于38℃水浴中快速融化。用75%酒精消毒細胞管，然后用新鮮配制的細胞培養液（含20%犢牛血清）將細胞釋成約2×105個/mL，并于細胞培養瓶中培養。細胞培養3～5代后，用不含血清的培養液清洗細胞2次，然后加入1 mL豬O型口蹄疫溫度敏感株病毒液，放置于37℃培養箱內。1 h后再加入不含血清的新鮮培養液，放入26℃溫箱內培養觀察。待細胞明顯發生CPE時，收集細胞并于-70℃冰箱凍存。將收集的病變細胞反復凍融3次后，吸取1mL再次感染新的IB-RS-2系細胞。以同樣的方法傳毒3代后，收集細胞提取病毒總RNA。

1.2.2 FMDV總RNA的提取及cDNA的擴增RNA的提取方法按照TRIzol LS Reagent試劑盒（Invitrogen）操作說明書進行。病毒RNA提取方法按照QIAGEN公司的RNA提取試劑盒操作說明書進行。然后以提取的RNA為模板，Oligo（dT）18為引物，利用AMV逆轉錄酶合成cDNA。擴增體系為 ：5 ×Reverse Transcriptase Buffer 5 μL，10 mM dNTP Mixture 3 μL，5 U/μL AMV Rrverse Transcriptase XL 2 μL ，40 U/μL Rnase Inhibitor 1 μL，RNA 12 μL ，N2 primer 1 μL，Oligo dT 引物 1 μL，42℃保溫 1 h。

1.2.3 引物設計 根據FMDV全基因組序列，設計了 5 對針對 L 區、P1、P2、P3（3C、3D）區基因片段的引物（表1），引物由上海生物工程有限公司合成。

表1 引物序列信息

1.2.4 基因的克隆 以合成的O型口蹄疫cDNA為模板，進行PCR擴增：95℃預變性5 min；94℃ 變性 1 min，55℃復性 45 s，72℃延伸 1 min，共 30 個循環；72℃延伸10 min。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。PCR產物經切膠回收純化后連接至pMD18-T載體，再將連接產物轉化到感受態細胞JM109內，挑斑并提取重組質粒進行初步PCR鑒定，將初步鑒定為陽性的重組質粒送上海生物工程有限公司進行測序鑒定，并將測序結果用生物軟件DNASTAR進行拼接。

2 結果與分析

2.1 病毒的傳代

將實驗室凍存的豬O型FMDV溫度敏感株感染IB-RS-2系細胞3代后，用顯微鏡觀察正常細胞與病毒感染后細胞的形態。觀察結果如圖1所示，正常的IB-RS-2系傳代細胞的形態是細胞致密，形態小而且清晰透亮；接毒的IB-RS-2系傳代細胞的形態是細胞脫落，形態不清，細胞顆粒較多且細胞之間出現較大的間隙。

2.2 目的基因的擴增

將病變的IB-RS-2細胞裂解后，提取病毒總RNA，并通過RT-PCR反轉錄出cDNA。以合成的引物進行PCR擴增，成功擴增出了與預計長度相符合的目的產物。擴增結果如圖2所示，L、P1、P2、P3（3C、3D）區基因擴增出的目的條帶大小分別為603、2 208、1 464、639、1 410 bp，均與預期的擴增目的片段大小相符。

2.3 目的基因的測序與序列比對

將擴增的目的基因用膠回收試劑盒純化回收后連接到pMD18-T載體上，送上海生工進行測序。將獲得的測序結果拼接后與野生型豬O型FMDV序列進行比對，兩者的同源性為88%。

將O型溫度敏感株FMDV序列與O型緬甸98FMDV毒株序列進行比對及分析，從O型口蹄疫病毒溫度敏感株感染293M細胞的結果來看，其對細胞的毒力明顯下降，并且其侵染細胞的最適溫度降為26℃，不再是37℃。以O型口蹄疫病毒緬甸98毒株基因序列作為參考，與溫度敏感株基因序列進行比對，結果如下：兩者L區基因的堿基錯配率占L基因全長的12%，錯配堿基分布均勻，無明顯規律，L基因編碼的蛋白是FMDV毒力強弱的重要因子，因此推測L區基因的突變是導致溫度敏感株毒力下降的主要原因；P1區是FMDV的蛋白外殼編碼區，其堿基錯配率較低，FMDV保守區域的堿基都沒有發生突變；P2區堿基錯配率最低；P3區堿基錯配率較高，但主要集中在3A和3B部分，3D區堿基非常保守。從各部分編碼蛋白功能來看，3D為RNA依賴的RNA聚合酶，能夠催化病毒RNA的合成，對于病毒的自我復制非常重要，因此其堿基序列非常保守，而3A、3B區與病毒侵染宿主的能力有關。

3 討論

筆者將實驗室凍存的豬O型口蹄疫病毒溫度敏感突變株在IB-RS-2系傳代細胞（豬腎的異倍體細胞）中傳毒5代后提取病毒總RNA，反轉錄得到了cDNA，并根據GenBank中提交的FMDV基因序列設計各區段基因引物，通過PCR擴增得到了與預期相符的O型口蹄疫病毒溫度敏感株的L、P1、P2和P3區目的基因片段。測序及序列比對結果表明，獲得的各區序列拼接后與野生型豬O型FMDV序列兩者同源性為88%，而O型口蹄疫病毒溫度敏感株毒力下降及溫度敏感的原因可能是其L基因和P3區部分基因堿基突變所致，具體突變部分還有待進一步研究。

[1]Li J，Lin T，Gao S D，et al.Expression，purification and activity detection of VP1 of A-type FMDV[J].Agricultural Science&Technology，2010，11（2）：23-26.

[2]魯 彬.口蹄疫病毒3D基因的真核表達及其表達產物的功能分析[J].中國獸醫學，2006，36（10）：800-804.

[3]Carrillo C，Tulman E，Del H G，et al.Comparative genomics of foot-and-mouth disease[J].Virus，2005，79（10）：6487-6504.

[4]尤永進，葛 艷，陳 波，等.口蹄疫病毒非結構蛋白3ABC基因的克隆及3AB基因的原核表達 [J].中國獸醫學報，2004，24（1）：131-134.

[5]吳錦艷，劉湘濤，胡永浩，等.豬口蹄疫病毒對三種動物細胞噬性的研究[J].甘肅農業大學學報，2005，40（3）：306-310.