SPE-HPLC法同時(shí)測定大白菜中吡蟲啉等5種農(nóng)藥殘留方法研究

李志堅(jiān)

（1.湖南省農(nóng)科院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，湖南 長沙 410125；2.湖南省食品測試分析中心，湖南 長沙 410125）

吡蟲啉、多菌靈、滅幼脲、除蟲脲、辛硫磷5種農(nóng)藥是蔬菜水果生產(chǎn)中應(yīng)用比較廣泛的低毒型農(nóng)藥，這些農(nóng)藥殘留在蔬菜或水果上，被人或其他高等動(dòng)物長期食用后，會(huì)在人體或動(dòng)物體內(nèi)蓄積起來，引起慢性中毒[1]。對(duì)這5種農(nóng)藥的殘留檢測方法報(bào)道很多，例如在黃瓜、毛豆、大蒜等中的吡蟲啉殘留量檢測[2-4]，在蘆薈、蘋果汁中的多菌靈檢測[5-6]、在白菜中的滅幼脲殘留檢測[7]、在小麥中的除蟲脲殘留量測定方法[8]；在玉米、大蒜中的辛硫磷檢測方法等[9-10]。其中，除辛硫磷是用氣相色譜法檢測外，其余4種農(nóng)藥殘留均常用高效液相色譜方法來測定。但到目前為止，還沒有只用一種方法就能同時(shí)檢測這些不同類型農(nóng)藥的殘留量的報(bào)道。而在實(shí)際農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，在低毒農(nóng)藥中摻加禁用農(nóng)藥或者多種農(nóng)藥混合施用的現(xiàn)象十分普遍，因此研究一種簡單快速的分析方法能同時(shí)檢測這些不同類型的農(nóng)藥，為相關(guān)檢測機(jī)構(gòu)的農(nóng)殘檢測提供參考，為無公害蔬菜的生產(chǎn)提供技術(shù)支撐。

l 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 供試藥劑 供試樣品為大白菜（湖南省農(nóng)科院菜市場）；吡蟲啉、多菌靈、除蟲脲、滅幼脲、辛硫磷標(biāo)準(zhǔn)品，濃度均為100μg/mL（農(nóng)業(yè)部環(huán)境保護(hù)科研監(jiān)測所）；甲醇和乙腈（TEDIA，HPLC級(jí)），Na－Cl（分析純），實(shí)驗(yàn)用水為Millipore 18.2MQ·cm的高純水（下文中簡稱水）。

1.1.2 試驗(yàn)儀器 LC-20A液相色譜系統(tǒng)：配備二元高壓梯度泵、PDA檢測器，柱溫箱，自動(dòng)進(jìn)樣器及LC-Solution色譜數(shù)據(jù)處理工作站等（日本Shimadzu公司）；Phenomenex C18高效液相色譜柱（5μm，250 mm×4.6 mm）；氮吹儀（MTN-2800D）；固相萃取裝置（VNW Technologies GmbH），SUPELCO NH2小 柱（500 mg/6mL）；FJ-200高速分散均質(zhì)機(jī)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 樣品處理（1）提取。向25 g白菜樣品中加入50 mL乙腈，高速勻漿3 min后，過濾至裝有7～8 g氯化鈉的具塞量筒中，加塞劇烈振蕩2 min，靜置分層。吸取上層提取液10 mL，放入50 mL梨形瓶中，于40℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至近干，加入4.0 mL（甲醇+二氯甲烷）混合液（1+99）溶解殘?jiān)w上鋁箔，待凈化。（2）凈化。將氨基柱（83.3 mg/mL）用5.0 mL（甲醇+二氯甲烷）混合液（1+99）充分活化，將上述待凈化液上柱，用20 mL刻度試管接收洗脫液，用6 mL（甲醇+二氯甲烷）混合液（1+99）分兩次充分洗滌梨形瓶，依次過柱，收集洗脫液。將試管置于氮吹儀上吹至近干，用甲醇準(zhǔn)確定容至2.5 mL，于旋渦混合器上混合均勻后用0.45μm有機(jī)濾膜過濾，上液相色譜儀檢測。

1.2.2 色譜條件優(yōu)化 色譜柱溫為40℃，進(jìn)樣量20μL。針對(duì)波長、流動(dòng)相、流動(dòng)相流速3個(gè)方面進(jìn)行優(yōu)化，選取200～400 nm波長范圍進(jìn)行掃描來確定檢測波長；選擇甲醇+水、乙腈+水、甲醇+乙腈+水3種流動(dòng)相，設(shè)定0.5、0.8、1.0、1.5 mL/min 4個(gè)流動(dòng)相流速進(jìn)行洗脫，最后根據(jù)色譜結(jié)果來確定最佳色譜條件。

1.2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 準(zhǔn)確分別吸取10μL的吡蟲啉、多菌靈、除蟲脲、滅幼脲、辛硫磷標(biāo)準(zhǔn)品（100μg/mL），用甲醇定容至1.0 mL，配制成1μg/mL的單一農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)使用液。準(zhǔn)確吸取3、5、10、50、100μL的5種農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品（100μg/mL），分別定容至10 mL，配制成0.03、0.05、0.1、0.5、1.0μg/mL混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。按最佳色譜條件進(jìn)行測定，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2 結(jié)果與分析

2.1 波長的選擇

二極管陣列檢測器在200～400 nm范圍內(nèi)的吸收光譜掃描結(jié)果表明：吡蟲啉最大吸收波長為270 nm，多菌靈和辛硫磷在280 nm處均有較大吸收，除蟲脲和滅幼脲在254 nm處有較大吸收，但由于254 nm是大多數(shù)含有苯環(huán)結(jié)構(gòu)的化合物的特征吸收波長，干擾相對(duì)較大，而在270 nm處5種目標(biāo)物均有較大吸收，因此對(duì)于單波長檢測器，可選擇270 nm處作為檢測波長。

2.2 流動(dòng)相的選擇

為達(dá)到經(jīng)濟(jì)、快速、準(zhǔn)確的目的，以及令人滿意的分離效果，選擇了甲醇+水、乙腈+水、甲醇+乙腈+水作為流動(dòng)相分別進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果表明：以甲醇+乙腈按3+1比例混合作為有機(jī)相，與水一起進(jìn)行梯度洗脫，分離效果較為理想。利用乙腈和甲醇在分離選擇性上的不同解決了不同成分的分離（甲醇和乙醇是質(zhì)子性，乙腈和四氫呋喃是非質(zhì)子性），起到了減小柱壓、提高分離度、改善峰型的作用。

2.3 流動(dòng)相流速的選擇

流動(dòng)相流速較大雖能縮短分析時(shí)間，但會(huì)導(dǎo)致5種目標(biāo)物得不到理想的分離，或者與雜質(zhì)一起出峰，從而影響積分的準(zhǔn)確性；流速過小則會(huì)使分析時(shí)間加長，不能獲得理想的峰形。因此，從分離度、儀器穩(wěn)定性和峰形等綜合考慮，通過不同流速進(jìn)行試驗(yàn)，尋找最佳流速。試驗(yàn)結(jié)果說明，當(dāng)流速為1.5 mL/min時(shí)出峰較早，導(dǎo)致目標(biāo)峰與雜質(zhì)峰重疊產(chǎn)生干擾；當(dāng)流速為0.5 mL/min時(shí)，出峰時(shí)間推遲，能與雜質(zhì)峰完全分開，但不能獲得理想的峰形；當(dāng)流速為1.0 mL/min時(shí)，5種農(nóng)藥在20 min之內(nèi)達(dá)到完全分離，而且能夠獲得較好的峰形，因此確定1.0 mL/min為最佳流速。

最佳色譜條件：柱溫為40℃，進(jìn)樣量為20μL，檢測波長為270 nm，流動(dòng)相為水與甲醇+乙腈混合液（3+1），流速為1.0 mL/min。采用梯度洗脫，具體操作見表1。通過保留時(shí)間定性，外標(biāo)法定量。5種農(nóng)藥混標(biāo)溶液的色譜圖見圖1，大白菜樣品色譜圖見圖2。

表1 流動(dòng)相梯度洗脫程序

圖1 5種農(nóng)藥混合標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖

圖2 大白菜樣品色譜圖

2.4 線性范圍和方法檢出限

在最佳色譜條件下，取系列濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液進(jìn)行色譜測定，由數(shù)據(jù)處理工作站直接制作校準(zhǔn)曲線、回歸方程及相關(guān)系數(shù)（見表2）。從表2中可知：5種農(nóng)藥檢測的線性回歸方程的相關(guān)系數(shù)均大于0.99，最低檢出限在0.020～0.030μg/L。

表2 5種農(nóng)藥的線性范圍、線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)和檢出限

2.5 回收率與精密度檢驗(yàn)

為了驗(yàn)證方法的可靠性，進(jìn)行了回收率試驗(yàn)。取5份大白菜樣品，分別加入已知量的吡蟲啉、多菌靈、除蟲脲、滅幼脲和辛硫磷標(biāo)準(zhǔn)溶液，按最佳色譜條件重復(fù)測定5次，色譜圖見圖3，結(jié)果見表3。從表3可知，5種農(nóng)藥的平均回收率在88.5%～98.8%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在1.84%～4.62%之間。

表3 5種農(nóng)藥的回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差

圖3 加標(biāo)試樣色譜圖

3 結(jié)論

該試驗(yàn)采用固相萃取-高效液相色譜法同時(shí)檢測大白菜中吡蟲啉等5種農(nóng)藥殘留量。從5種農(nóng)藥的回收率、變異系數(shù)和最低檢出限可以看出，該方法的準(zhǔn)確度和精密度均較高，而且操作較簡單，便于推廣應(yīng)用，適用于大部分蔬菜中吡蟲啉等5種農(nóng)藥殘留量的測定，是可以滿足現(xiàn)代社會(huì)需求的簡便、快速、靈敏、準(zhǔn)確的多種農(nóng)藥殘留同時(shí)檢測的方法。

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