免疫細胞化學法檢測羥基喜樹堿對乳腺癌MCF-7細胞的TIMP-3及空泡化作用

蒲錦蘭 周 瀅

1.四川省劍閣縣人民醫院藥劑科，四川劍閣 628300；2重慶醫科大學中醫藥學院，重慶 400016

免疫細胞化學法檢測羥基喜樹堿對乳腺癌MCF-7細胞的TIMP-3及空泡化作用

蒲錦蘭1周 瀅2▲

1.四川省劍閣縣人民醫院藥劑科，四川劍閣 628300；2重慶醫科大學中醫藥學院，重慶 400016

目的探索羥基喜樹堿對乳腺癌細胞MCF-7細胞信號轉導相關基因TIMP-3表達，觀察羥基喜樹堿處理乳腺癌細胞MCF-7細胞形態的改變，從而探討羥基喜樹堿在乳腺癌治療中的潛在新靶點。 方法 以乳腺癌細胞MCF-7為研究模型，細胞暴露于羥基喜樹堿濃度為10、40、80mg/L的培養液中24h，PBS組為對照組。采用免疫組化法檢測羥基喜樹堿（HCPT）對乳腺癌MCF-7細胞TIMP-3表達特征及細胞形態的變化。 結果 HCPT對TIMP-3誘導表達作用差異不明顯，但HCPT處理組細胞呈現明顯的空泡化。 結論HCPT可誘導乳腺癌MCF-7細胞空泡化作用。

羥基喜樹堿；空泡化；免疫細胞化學法；金屬蛋白酶組織抑制劑-3

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，據資料統計，發病率占全身各種惡性腫瘤的7%～10%。它的發病常與遺傳有關，以及40～60歲、絕經期前后的婦女發病率較高。迄今為止，乳腺癌的病因及其惡性進展的具體機制尚未完全闡明，隨著分子生物學的快速發展，從基因角度尋找乳腺癌治療中的潛在新靶點對改善患者病情具有非常重要的意義。

羥基喜樹堿（hydroxycamptothecin，HCPT）是所有天然喜樹堿同類物或合成喜樹堿中活性最大的天然衍生物，是一種純天然的抗癌藥物[1]，其可通過激活NF-κB誘導人促進乳腺癌Bcap-37細胞凋亡[2]，亦可依賴Caspase3途徑促進細胞凋亡[3]。Liu W等[4]發現HCPT可促進p21WAF1/CIP1表達上調，并通過p53依賴/非依賴途徑誘導人乳腺癌MCF-7細胞凋亡，達到殺傷癌細胞的目的。TIMP-3則作為MMP的抑制劑之一[5]，故其TIMP-3表達上調有利于抑制腫瘤細胞增殖并促進其凋亡[6]。然而，迄今有關羥基喜樹堿與人乳癌細胞的作用機制尚不明確，有待進一步的研究和探討。本實驗運用免疫細胞化學法檢測羥基喜樹堿對乳腺癌乳腺癌MCF-7細胞的影響，探討羥基喜樹堿在乳腺癌治療中的潛在新靶點，以期為臨床治療乳腺癌提供新思路。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

人乳腺癌細胞株MCF-7，購自重慶醫科大學生命科學研究院。HCPT注射液購自吉林省長春天誠藥業有限公司，胎牛血清購自杭州四季青公司，RPMI-1640培養基、胰蛋白酶、Hepes、二甲基亞砜（DMSO）均購于Gibco公司。Transwell小室購自CORNING公司，Matrigel膠購于BD Biosciences公司，引物由上海生工有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 細胞的藥物處理 人乳腺癌細胞株MCF-7由重慶醫科大學生命科學研究院提供。MCF-7細胞常規培養于RPMI-1640培養基（含10%新生胎牛血清，20mmol/L Hepes，2.0g/L碳酸氫鈉，100U/mL青霉素和 100U/mL鏈霉素），置37℃、5%CO2細胞培養箱中培養，2～3d傳代1次。PBS空白對照組加入20μL PBS緩沖液，HCPT誘導組施加TCPT，使其終濃度分別為10、40、80mg/L細胞培養液，顯微鏡下顯色為陰性者陰性對照組。

1.2.2細胞組化檢測TIMP-3在細胞中的表達 取MCF-7細胞經消化離心后以5×107個/L的密度接種于預置蓋玻片的6孔板中，待細胞貼壁、基本長滿蓋玻片后，更換無血清培養基饑餓24h，24h后分別向各孔中施加TCPT，使其終濃度分別為10、40、80mg/L，24h后吸出細胞培養液，取出細胞爬片，0.01mol/L PBS沖洗3次，每次3min，用4g/L多聚甲醛固定，每一濃度組制備16張標本。對細胞爬片進行TIMP-3免疫組化SP法染色，染色結果在顯微鏡下觀察并攝影。

1.3 數據統計

采用SAS 8.2統計軟件對數據進行分析處理，mRNA相對表達量以均數±標準差表示，組間均數比較采用t檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

免疫細胞組化結果顯示，TIMP-3在MCF-7細胞內均有表達，僅從表觀上看，HCPT對其誘導表達作用差異不明顯，但HCPT處理組細胞呈現明顯的空泡化，見圖1。

3 討論

近年來有研究表明，HCPT及其衍生物可通過作用于DNA拓撲異構酶Ⅰ來抑制DNA復制、轉錄和有絲分裂，達到抗腫瘤作用。HCPT衍生物7-乙基羥基喜樹堿可以募集S期細胞，促進吉西他濱（抗腫瘤藥物）代謝物的聚集，減少關卡蛋白激酶1的合成，即7-乙基羥基喜樹堿有助于腫瘤細胞敏化，促進其他化療藥物的效應[7]。HCPT的抑癌機制的研究深入將有助于進一步對其進行結構改造和臨床應用。以往的研究發現，HCPT對乳腺癌細胞株MCF-7細胞的增殖起抑制作用。基因表達譜研究發現，HCPT誘導后，共獲得了差異表達信號轉導相關基因55個，涉及6個信號通路[8]。

本實驗利用免疫細胞化學法檢測了羥基喜樹堿（HCPT）對乳腺癌MCF-7細胞的空泡化作用。HCPT對TIMP-3誘導表達作用差異不明顯，但HCPT處理組細胞呈現明顯的空泡化，因此，HCPT可誘導乳腺癌MCF-7細胞空泡化作用，希望本研究對尋找羥基喜樹堿在乳腺癌治療中的潛在新靶點有所幫助，并為臨床治療乳腺癌提供新思路。

[1]Ling YH，Tseng MT，Nelson JA.Differentiation induction of human promyelocytic leukemia cells by 10-hydroxycamptothecin，a DNA topoisomerase I inhibitor[J].Differentiation，1991，46（2）：135-141.

[2]葉孟，林蕾，方勇等.Bay117802抑制羥基喜樹堿誘導的人乳腺癌Bcap37細胞凋亡[J].中國臨床藥理學與治療學，2005，7：755-759.

[3]葉孟，林蕾，方勇.羥基喜樹堿依賴Caspase3途徑誘導人乳腺癌Bcap37細胞凋亡[J].中國臨床藥理學與治療學，2005，10（8）：881-883.

[4]Liu W，Zhang R.Upregulation of p21WAF1/CIP1in human breast cancer cell lines MCF-7and MDA-MB-468undergoing apoptosis induced by natural product anticancer drugs 10-hydroxycamptothecin and camptothecin through p53-dependent and independent pathways[J].Int J Oncol，1998，12（4）：793-804.

[5]Uría JA，Ferrando AA，Velasco G，et al.Structure and expression in breast tumors of human TIMP-3，a new member of the metalloproteinase inhibitor family.Structure and expression in breast tumors of human TIMP-3，a new member of the metalloproteinase inhibitor family[J].Cancer Res，1994，54（8）：2091-2094.

[6]Finan KM，Hodge G，Reynolds AM，et al.In vitro susceptibility to the pro-apoptotic effects of TIMP-3gene delivery translates to greater in vivo efficacy versus gene delivery for TIMPs-1or-2[J].Lung Cancer，2006，53（3）：273-284.

[7]Gálvez-Peralta M，Dai NT，Loegering DA，et al.Overcoming S-phase checkpoint-mediated resistance：sequence-dependent synergy of gemcitabine and 7-ethyl-10-hydroxycamptothecin （SN-38） in human carcinoma cell lines[J].Mol Pharmacol，2008，74（3）：724-735.

[8]周萍，付麗娟.羥基喜樹堿對乳腺癌細胞MCF-7細胞細胞信號轉導相關基因信號通路的影響研究[J].西南大學學報：自然科學版，2010，33（4）：83-87.

The detection of the TIMP-3expression and the cellular vaculization induced by HCPT detected with immunocytochemical method

PU Jinlan1ZHOU Ying2▲1.The Pharmacy Department of the People′s Hospital of Jiange County in Sichuan Province,Jiange 628300,China;2.College of Traditional Chinese Medical,Chongqing Medical University,Chongqing 400016,China

ObjectiveTo explore the different concentration of HCPT effects on TIMP-3expression in breast tomor cell line MCF-7and the shapes of MCF-7cells were observed in this paper.MethodsMCF-7cell cultures were exposed to HCPT at concentrations of 10,40,80mg/L for 24h.PBS group as control group.Immunocytochemical method was used to measure the TIMP-3expression in breast tomor cell line MCF-7and the shapes of MCF-7cells for each sample.ResultsThe upregulated expression of TIMP-3in the MCF-7cell line could not be obviously induced by different concentration of HCPT,but the obvious presentation of the cellular vaculization could be induced by the cells of the disposed guoup of HCPT.ConclusionThe cellular vaculization for MCF-7cells can be induced by HCPT.

HCPT;Cellular vaculization;Immunocytochemical method;TIMP-3

R392-33

A

1674-4721（2012）09（a）-0007-02

重慶市衛生局中醫藥科技計劃項目（NO：2010-2-66）。

蒲錦蘭，主管中藥師，主要工作方向是藥劑科藥房工作及臨床藥學工作。

▲通訊作者：周瀅，博士，副教授。

2012-05-02 本文編輯：林利利）