LC－MS/MS法測定人血漿中氨氯地平的濃度

王 燕，李鵬飛，馬 萍，安卓玲，張 茜，羅 戀，劉麗宏

（1.第二炮兵總醫院藥學部，北京 100088；2.湖北中醫藥大學，湖北 武漢 430065）

氨氯地平是一種1，4－二氫吡啶類的鈣離子拮抗劑，阻滯心肌和血管平滑肌細胞外鈣離子經細胞膜的鈣離子通道進入細胞，直接舒張血管平滑肌，臨床主要用于治療高血壓和心絞痛。與同類型的其他藥物相比，該藥具有服藥劑量低、藥效維持時間長等特點，目前已成為臨床一線用藥。文獻報道生物樣品中氨氯地平濃度測定的方法，主要有氣相色譜法（GC）[1]，高效液相色譜（HPLC）法[2－3]，液 相色譜－串 聯質譜 （LC－MS/MS）[4－14]法，酶聯吸附免疫分析（ELISA）[15]法等。針對以往檢測方法檢測限低，樣本前處理過程復雜、費時的缺點，本實驗擬建立一種靈敏度更高、樣本前處理過程簡便省時的LC－MS/MS法，旨在用于準確測定人血漿中氨氯地平含量，并用于氨氯地平的藥動學和生物等效性研究。

1 實驗部分

1.1 主要儀器

3200Q－trap型液相色譜－串聯質譜儀：配有電噴霧離子化源（ESI）以及Analyst 1.5.1數據處理軟件，美國Applied Biosystem公司產品；Agilent 1100高效液相色譜系統：包括四元輸液泵，自動進樣器，切換閥，美國 Agilent公司產品。

1.2 主要試劑

苯磺酸氨氯地平對照品：中國藥品生物制品檢定所提供，批號100374－200903，含量99.4%；替米沙坦對照品：廣州清平制藥有限公司產品，批號M060601，含量99.8%；甲醇、乙腈為色譜純；其它試劑均為分析純；空白人血漿由第二炮兵總醫院血液科提供。

1.3 溶液的配制

儲備液：精密稱取6.83mg苯磺酸氨氯地平對照品（含氨氯地平5mg），置于5mL量瓶中，加V（乙腈）∶V（水）＝80∶20的溶液溶解，并稀釋至刻度，配制成1.000g/L的氨氯地平儲備液。

標準系列溶液：將1.000g/L的氨氯地平儲備液用乙腈逐級稀釋到100.000μg/L的母液。分別取適量母液，用乙腈稀釋至標準曲線所需濃度，氨氯地平溶液的濃度分別為0.100、0.300、1.000、3.000、10.000、20.000μg/L。分別取適量母液，用乙腈稀釋至質控樣本所需濃度，低、中、高濃度分別為0.300、3.000、16.000μg/L。

內標：精密稱取10.00mg替米沙坦對照品，置于100mL容量瓶中，加乙腈溶解，并稀釋至刻度，配制成0.100g/L的儲備液。取適量替米沙坦儲備液用乙腈稀釋至濃度為5.000μg/L，作為內標溶液。

1.4 LC－MS/MS分析條件

1.4.1 色譜條件 色譜柱：Eclipse XDB－C18柱（4.6×150mm×5μm）；流動相：甲醇－1mM 乙酸銨溶液－0.1%甲酸溶液梯度洗脫，梯度條件列于表1；流速：1 000μL/min，分流比1∶1；柱溫：25℃；進樣量：20μL。

表1 梯度洗脫條件Table 1 Condition of gradient elution

1.4.2 質譜條件 離子源：離子噴霧離子化源；離子噴射電壓：5 500V；溫度：580℃；源內氣體1（GS1，N2）壓力：310kPa；氣體2（GS2，N2）壓力：379kPa；氣簾氣體（N2）壓力：103kPa；掃描方式為多重反應監測（MRM）；碰撞氣（N2）壓力：Medium；氨氯地平、替米沙坦解簇電壓（DP）均為：34V；碰撞電壓（CE）分別為：14eV、50 eV；氨氯地平、替米沙坦用于定量分析的離子反應分別為 m/z 409.2→238.1和m/z 515.1→276.1。

1.5 血漿樣品處理

向1.5mL EP管中依次加入血漿樣本100 μL，乙腈溶液100μL，替米沙坦內標溶液100 μL，渦流30s，以13 200r/min離心5min。取150μL上清液進行LC－MS/MS分析，進樣量20 μL。

2 方法與結果

2.1 質譜分析

將氨氯地平、替米沙坦儲備液用乙腈稀釋至50.000μg/L，采用蠕動泵模式進樣，按1.4.2項操作，進行碎片離子分析，相應的二級全掃描質譜圖示于圖1。

圖1 氨氯地平（a）、內標替米沙坦（b）的 [M＋H]＋的二級全掃描質譜圖Fig.1 Full－scan product ion spectra of[M＋H]＋for Amlodipine（a）and internal standard Telmisartan（b）

2.2 特異性考察

分別取受試者的空白血漿、空白血漿添加標準系列溶液、給藥后實際樣本，按1.5項處理3個樣品，進樣20μL，其色譜圖示于圖2。氨氯地平和內標替米沙坦的保留時間分別為3.40和3.88min，單個樣本的測試時間為5.5min。結果表明：內源性物質不干擾氨氯地平和替米沙坦的測定。

圖2 LC－MS/MS測定人血漿中氨氯地平（Ⅰ）和內標替米沙坦（Ⅱ）的典型MRM色譜圖Fig.2 MRM chromatograms Amlodipine（Ⅰ）and internal standard Telmisartan（Ⅱ）

2.3 線性關系考察

以血漿中待測物濃度為橫坐標，待測物與內標物的峰面積比值為縱坐標，用加權（W＝1/x2）最小二乘法進行回歸，求得回歸方程為：y＝0.017 1x＋0.000 376（r＝0.996 7），根據標準曲線，氨氯地平的線性范圍為：0.100～20.000μg/L，定量下限為0.100μg/L。

2.4 準確度與精密度

方法學考察的低、中、高3個濃度分別為0.300、3.000、16.000μg/L，考察批次為3次，結果列于表2。結果表明，此方法的精密度和準確度偏差均在±15%以內。

表2 血漿中氨氯地平LC－MS/MS測定方法的準確度與精密度（n＝18）Table 2 Precision and accuracy of Amlodipine in human plasma by LC－MS/MS（n＝18）

2.5 提取回收率和基質效應

取空白血漿100μL，制備低、中、高3個濃度的質控樣本 （濃度 分別為 0.300、3.000、16.000μg/L），每濃度3個樣本。同時另取空白血漿100μL，經乙腈沉淀蛋白后，將上清液于40℃下氮氣吹干，加入100μL蒸餾水，再加入相應濃度的標準溶液和內標，處理后進行LCMS/MS分析，獲得相應峰面積，以每一濃度兩種處理方法測得峰面積比值，計算提取回收率，氨氯地平低、中、高3個濃度提取回收率分別為（97.84±6.15）%、（97.77±4.56）%、（94.90±2.90）%，內標替米沙坦提取回收率為（88.96±1.82）%。以蒸餾水代替空白血漿，進行上述相應操作制備基質效應考察樣本。以每一濃度兩種處理方法測得的濃度比值計算基質效應，氨氯地平的基質效應為（－28.56±3.81）%，內標替米沙坦的基質效應為（8.63±1.61）%。結果顯示：血樣中氨氯地平和內標替米沙坦提取回收率均較高且穩定，血樣中基質對內標替米沙坦的基質效應較小，氨氯地平基質效應為（－28.56±3.81）%，基質效應比較穩定，因此，均不影響準確測定。

2.6 穩定性考察

分別在－20℃反復凍融3次、－20℃下凍存60d、進樣器放置14h（每批次每濃度各3樣本），3種條件下考察方法的穩定性，結果列于表3。結果表明氨氯地平在這3種條件下的穩定性良好。

表3 氨氯地平LC－MS/MS測定方法的3種穩定性考察結果（n＝3）Table 3 Results of stabilities of Amlodipine in human plasma by LC－MS/MS（n＝3）

2.7 方法學應用

22名健康受試者，口服2片苯磺酸氨氯地平片（含苯磺酸氨氯地平10mg），平均血藥濃度－時間曲線示于圖3。

3 討 論

氨氯地平是弱堿性化合物，實驗中發現它在堿性和中性流動相中柱保留能力較強，在酸性流動相中易被流脫下來，為提高信噪比和定量限，本實驗設計了甲醇－1mM乙酸銨水溶液－1mM乙酸銨（0.1%甲酸）水溶液三相梯度洗脫，通過1mM乙酸銨水溶液使氨氯地平在色譜柱上進行有效的保留和富集，再通過含酸的高比例甲醇溶液達到快速和完全的洗脫。實驗之初設置的是等度洗脫方法，但之后空白血漿加藥樣本發現較嚴重的前沿基質抑制現象，故改為梯度洗脫的方式。在系統優化的基礎上，最終確立了一個分析時間為5.5min的方法，使氨氯地平和內標均獲得滿意的響應、峰形和保留時間。

圖3 22名健康受試者口服10mg苯磺酸氨氯地平后平均血藥濃度－時間曲線Fig.3 Mean plasma concentration versus time rofile of amlodipine in 22healthy volunteers after oral administration of 10mg amlodipine besylate

常用的樣品前處理方法有液－液萃取法、固相萃取法和沉淀蛋白法等，為了提高氨氯地平檢測的靈敏度，文獻多采用液－液萃取法[3－9]，由于氨氯地平結構中的二氫吡啶環為堿性含氮雜環，血樣先堿化使氨氯地平游離后再用有機試劑提取，可提高提取回收率，但堿化試劑的堿性不能太強，否則易使結構中的羧酸酯發生堿水解反應。由于該檢測方法有效地提高了信噪比，使化合物和內標均可與前沿基質峰完全分離，因此，本實驗的樣本前處理采用了快速的一步沉淀蛋白法，就達到了0.100μg/L的定量靈敏度，既滿足了血漿中微量氨氯地平濃度測定的要求，又節省了大量的樣本前處理時間，適用于氨氯地平的藥動學和生物等效性研究。

此外，二氫吡啶類藥物對光不穩定，所以實驗過程中要注意嚴格避光，操作過程中用棕色容器，同時樣品配制過程和分析過程要快速，盡量縮短整個分析時間，從而提高分析結果的可靠性。

本研究所建立的檢測方法前處理過程簡單，分析時間短，靈敏度高、專屬性強，可用于氨氯地平人體藥物動力學實驗。

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