氣相色譜－質譜聯(lián)用快速篩查尿樣中麻醉劑類藥物

楊志勇，王占良，張建麗，張亦農

（國家體育總局中國反興奮劑中心，北京 100029）

麻醉劑類藥物主要包含嗎啡類藥物、可卡因類藥物和大麻，被世界反興奮劑機構（WADA）列入禁藥名單[1]。臨床上嗎啡類藥物屬阿片類生物堿，為阿片受體激動劑，激動中樞神經阿片受體而產生強大的鎮(zhèn)痛作用，主要經肝臟代謝，在肝內與葡萄糖醛酸結合，少量為游離型；代謝物主要包含可待因、嗎啡、雙氫可待因、6－乙酰嗎啡、羥考酮等，經腎臟排泄，尿樣中主要為結合型代謝物。可卡因別名古柯堿，是人類發(fā)現的第一種具有局麻作用的天然生物堿，主要經肝臟代謝為苯甲酰愛康寧，在肝內與葡萄糖醛酸結合，經腎臟排泄，尿樣中主要為結合型代謝物。大麻主要成分為四氫大麻酚、大麻二酚和大麻酚，主要經肝臟代謝為四氫大麻酚酸，在肝內與葡萄糖醛酸結合，經腎臟排泄，尿中主要為結合型代謝物，四氫大麻酚酸為WADA鑒別運動員是否服用大麻的唯一目標定量物質[1]。

以上的7種尿樣中麻醉劑常見代謝物質均為葡萄糖醛酸結合型代謝物，常規(guī)分析方法都需要酶解反應后，去除葡萄糖醛酸分析；該7種物質的酸堿性差異很大，可待因、嗎啡、雙氫可待因、6－乙酰嗎啡和羥考酮為堿性，苯甲酰愛康寧和四氫大麻酚酸為酸性，液液提取需要酸、堿性分別提取，費時費力；提取溶劑也有差別，苯甲酰愛康寧需要使用特殊的混合溶劑（V（氯仿）∶V（異丙醇）＝9∶1）；而嗎啡的液液提取回收率很差。固相萃取技術的出現解決以上的液液提取的不足，樣品經酶解后直接經過Oasis HLB小柱純化，樣品回收率和檢測限均顯著提高。

目前，對此類藥物的定性分析主要采用GC/MS、LC/MS 方 法[2－20]。本 實 驗基 于 GC/MS技術和固相萃取簡單快速的樣品前處理過程，建立一個快速準確檢測尿樣中的麻醉劑類藥物代謝物的方法，旨在快速檢測尿樣中7個常見代謝物：可待因、嗎啡、四氫大麻酚酸、雙氫可待因、苯甲酰愛康寧、6－乙酰嗎啡、羥考酮（其結構分別示于圖1）。

圖1 可待因、雙氫可待因、四氫大麻酚酸、苯甲酰愛康寧、6－乙酰嗎啡、嗎啡、羥考酮的化學結構式Fig.1 Chemical structure of Codeine，Dihydrocodeine，Carboxy－THC，Benzoylecgonine，6－acetylmorphine，Morphine，and Oxycodone

1.1 儀器和試劑

7890GC－5975MS氣相色譜－質譜儀：美國Agilent公司產品；色譜柱 HP－5MS柱：美國Agilent公司產品；低溫恒溫循環(huán)液浴兩用槽：杭州雪中炭技術公司產品；Legend T低速離心機：美國 Thermo公司產品；Dri－block DB－3D 氮氣吹干裝置：美國Techne公司產品；沃特斯20孔固相萃取裝置和HLB Oasis 3cc 60mg反相固相萃取柱：美國Waters公司產品。

可待因、嗎啡、雙氫可待因、苯甲酰愛康寧、6－乙酰嗎啡和羥考酮從澳大利亞購買，四氫大麻酚酸為實驗室間贈送。分別精密稱取配制成1g/L的甲醇溶液（四氫大麻酚酸為0.1g/L）；β－葡萄糖醛酸甙酶和甲基睪酮（內標，20mg/L）購自Sigma公司；甲醇為色譜純；磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀均為分析純。0.1mol/L磷酸氫二鉀/磷酸二氫鉀磷酸鹽緩沖液pH 6.9；三甲基硅基三氟乙酰胺：MSTFA，美國Sigma公司產品；三甲基碘硅烷：TMSI，美國Sigma公司產品；二硫代赤糖蘚醇：分析純，美國Sigma公司產品，以V（MSTFA）∶V（TMSI）∶V（二硫代赤糖蘚醇）＝1 000∶3∶1的溶劑為衍生化試劑。

1.2 樣品前處理

尿樣2mL，20μL內標（甲基睪酮，20mg/L）甲醇溶液，加入1mL磷酸緩沖液，50μLβ－葡萄糖醛酸甙酶（2 500unit），55℃恒溫水浴中靜置120min，取出樣品冷卻至室溫，上樣 HLB Oasis 3cc 60mg反相固相萃取柱（依次用3mL甲醇，3mL水活化），3mL20%甲醇水溶液淋洗后，采用3mL甲醇洗脫，60℃下用氮氣吹干，加入衍生化試劑50μL，振蕩3s后轉移入小瓶中，加蓋，于70℃反應30min，進樣2μL，進行GC/MS分析。

1.3 標準溶液的配制

分別準確量取7種藥物的標準儲備溶液配制成混合標準溶液，濃度列于表1。取10μL該溶液，空白尿樣2mL，加入20μL內標，按1.2步驟開始分析，結果示于圖2。

表1 化合物1～7的質譜參數Table 1 Mass parameters of compounds 1—7

1.4 儀器條件

色譜柱 HP－5MS柱（25m ×0.2mm×0.33 μm）；進樣口溫度：280℃；接口溫度：300℃；采用恒壓模式，柱壓：75kPa；分流比10∶1；進樣2 μL；程序升溫：180℃保持0min，以10℃/min升到220℃，以5℃/min升到260℃，以10℃/min升到300℃，保持10min；質譜離子源為EI源，離子源溫度230℃，源電壓70eV；采集模式：SIM方式。溶劑延遲時間6min。化合物的選擇離子列于表1。

1.5 方法靈敏度

量取1.3中的標準儲備溶液稀釋成1mg/L的溶液，量取此溶液加入2mL的空白尿樣中，配制成含量為2、5和10mg/L的標準添加尿樣，采用1.2的樣品處理方法，進樣分析，按照S/N＝3的要求，計算檢測限，檢測限圖示于圖3。

1.6 方法的重現性

高、中、低3種濃度的標準溶液中分別加入空白尿樣2mL，每個濃度平行測定6份，按照1.2的前處理方法進行分析。內標校正后與平行處理的標準溶液添加的空白質控樣品比對計算回收率，結果列于表2。

圖2 空白樣本添加標準品后的選擇離子圖和化合物1～7的質譜圖Fig.2 Mass spectra of compounds 1—7and spectra of blank urine spiked quality control solution

圖3 7種常見代謝物的檢測限圖Fig.3 Detection limit spectrum of 7kinds of narcotic agents

表2 化合物1～7的相對回收率Table 2 The relative recovery of compounds 1—7

2 結果與討論

2.1 譜圖

從圖2的GC/MS選擇離子圖中可以看到，空白尿樣中添加的7個標準物質與內標具有良好的分離度，各化合物的保留時間與內標位置適中，滿足色譜分離的要求。化合物1～7的質譜結果中均含有衍生化反應的準分子離子峰，化合物1、2、4的準分子離子峰為單個TMS的分子離子，其余的則為2TMS的分子離子，衍生化反應主要發(fā)生在化合物的羥基、酮基和羰基。化合物1、2、5～7的化學結構很相似，具有相似的母核，質譜圖中均具有[M－CH3]＋的碎片，而且強度比較一致，在10%左右，且具有相似的碎片離子 m/z 178、m/z 196、m/z 234或 m/z 236等。化合物3的質譜圖中含有[M－O＝COTMS]＋碎片，即m/z371，同時也是基峰；m/z473為[M－CH3]＋的碎片。化合物4的的分子離子峰為m/z361，主要碎片m/z240為連接兩個環(huán)狀結構的酯鍵斷裂形成，即[M－C6H5COO]＋碎片。

2.2 檢測限

化合物的檢測限結果示于圖3，從圖3可以看出，按照S/N＝3計算化合物1～7的檢測限均為5mg/L，以上結果滿足了尿樣檢測的需要。

2.3 回收率和重現性

在高、中、低3種濃度的回收率實驗中，化合物1～7的回收率結果分布在75%～123%之間，基本滿足了定性檢測要求。

2.4 應用舉例

本方法已成功應用于能力驗證《尿中常見毒物的測定》，成功檢出尿樣中的可待因和嗎啡，其選擇離子流圖示于圖4；另外該方法作為實驗室內標準方法用于檢測社會送檢的非運動員尿樣。

2.5 討論

固相萃取技術應用已經非常廣泛，其優(yōu)勢是解決了液體樣本中難于液液提取或濃度很低不易富集等困擾，一次將目標化合物全部提取，簡單而又省時，提高了檢測靈敏度和重現性；但是目前還沒有應用到興奮劑尿樣的常規(guī)檢測中，它還只是作為確證方法應用于可疑樣品的確證分析。隨著該方法的成熟和成本降低，將固相萃取技術應用到興奮劑尿樣常規(guī)檢測已是大勢所趨。

對于大部分實驗室，氣質聯(lián)用儀器為基本配置，因此，結合固相萃取技術的本方法具有更廣泛的適用性和實用性。

圖4 一例陽性樣品的選擇離子流圖Fig.4 Multiple reaction monitoring spectra of a positive sample

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