產低溫脂肪酶深海菌株的篩選、鑒定及酶學性質研究

王全富，侯艷華，藺一飛，李富超

（1.哈爾濱工業大學化工學院，黑龍江哈爾濱150001；2.哈爾濱工業大學海洋學院，山東威海264209；3.中國科學院海洋研究所實驗海洋生物學開放研究實驗室，山東青島266071）

深海及深海沉積物中微生物的生存面臨高壓，低溫或高溫、黑暗及低營養水平等幾個主要極端環境，經過長期的自然選擇，形成了極為特殊的生理結構和代謝機制。因此深海微生物的多樣性和資源開發受到越來越多的關注，有許多新藥物和新酶等資源正有待于研究和開發[1]。脂肪酶作為廣泛應用的一種工業用酶，目前使用的基本都是中溫酶，酶活性最適溫度一般都在50 ℃左右。同中溫酶相比，低溫酶在工業應用上有以下優勢：通過溫和的熱處理使低溫酶失活，快速而經濟地終止反應；生產過程在低溫或室溫下進行，無需加熱和冷卻，可以降低成本；生產過程便于監控。因此，低溫脂肪酶在食品工業領域中得到越來越廣泛的應用，如在酒類釀造、奶酪的批量生產、面包加工、肉類軟化和食品添加劑等方面[2]。由于深海微生物采樣、分離培養等多種因素的影響，國內外對深海微生物的研究還處于起步階段。本研究通過從鄂霍次克海域深海沉積物中分離篩選高產胞外脂肪酶的菌株，對其進行16 S rRNA 分子鑒定，并對酶學性質予以初步研究，為深海微生物酶資源在食品工業上的應用提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 菌株

深海沉積物樣品采集于由俄、韓、日、中四國共同組織的“海底冷泉與生命過程”聯合調查航次（2006年5月），深海微生物依常規沉積物的菌種稀釋方法從鄂霍次克海域采獲沉積物柱狀樣品（lv39-06-06-04-18H）中分離獲得。

1.2 培養基和培養條件

篩選培養基：蛋白胨10 g，酵母粉5 g，NaCl 30 g，MgSO41 g，（NH4）2SO41 g，K2HPO42 g，Tween80 10 mL，海水1 000 mL。10 ℃下150 r/min 搖床培養4 d，測其脂肪酶活性。

1.3 脂肪酶酶活力的測定

脂肪酶酶活力測定采用NaOH 滴定法進行。在溫度為35 ℃，反應時間為30 min 的條件下，每分鐘水解脂肪產生1 μmol 脂肪酸所需的酶量定義為一個脂肪酶活性單位（U）。

1.4 16S rRNA 基因序列測定與系統發育樹分析

1.4.1 細菌總DNA 的提取

按照CTAB 方法[3]。

1.4.2 16S rRNA 基因序列的PCR 擴增

采用細菌16S rRNA 基因的通用引物，引物序列為：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′和5′-GGTTA CCTTGTTACGACTT-3′。PCR 反應體系為20 μL，包括：1×PCR 緩沖液，1.6 mmol/L MgCl2，4×dNTP 混合物各100 μmol/L，引物各1.0 μmol/L，Taq DNA 聚合酶1個單位，模板DNA 1 μL。PCR 反應條件為：93 ℃，5 min；93 ℃，1 min；52 ℃，1 min；72 ℃，1 min 30 s，30個循環；72 ℃延伸10 min。

1.4.3 16S rRNA 基因文庫的構建

以上海華舜DNA 純化試劑盒對PCR 產物進行回收純化，克隆到pMD18-T 質粒載體上，并轉化大腸桿菌Top10 感受態細胞，然后進行陽性克隆的篩選；用北京賽百盛質粒純化試劑盒提取陽性克隆的質粒并進行酶切鑒定；酶切成功的質粒送交上海華大基因測序公司完成測序工作。測序引物為通用引物。

1.4.4 16S rRNA 基因序列測定與系統進化關系的分析

將所測定菌株130（EU913789）的16S rRNA 基因序列（大約1.3Kb），同GenBank 數據庫中選取的與菌株親源關系較近16S rRNA 基因序列，用BioEdit 軟件的多序列比對排列（Clustalw multiple alignment）進行序列比對；用DNAStar 軟件進行序列相似性比較；系統發育分析采用Mega2 軟件的鄰接法（neighborjoining method）進行；通過自舉分析（boot-strap）進行置信度檢測，自舉數據集為1 000 次。

1.5 脂肪酶酶活特性的測定

1.5.1 最適溫度測定

設置0、10、20、30、35、40、45、50、60 ℃9 個溫度梯度，測定不同溫度下的酶活力，以確定其最適溫度。

1.5.2 最適pH 測定

將酶在各pH 緩沖液NaAC/HAC（pH 5.0）；KH2PO4/Na2HPO4（pH6.0，7.0）；Tris-HCl （pH 8.0，9.0）；Na2HPO4/NaOH（pH 10.0，11.0）中于4 ℃保存2 h 后，測其脂肪酶活性。

1.5.3 熱穩定性測定

將酶液分別在30、40、50、60 ℃4 個溫度條件下依次保溫10、20、30、40 min，然后放入冰水混合物中，與未被保溫處理的酶活性相比較，測其脂肪酶活性。

1.5.4 金屬離子對酶活力影響的測定

金屬離子配制濃度為5 mmol/L，添加至酶活測定緩沖液中，35 ℃保溫15 min，測其脂肪酶活性。

2 結果與討論

2.1 產酶菌株的篩選

采用平板涂布法和平板劃線法從2216E 平板上分離純化到150 株深海細菌，對這些菌株產脂肪酶進行了篩選，其中菌株130 產酶活性最高達到42 U/mL。

2.2 菌株130 的16SrRNA 基因序列和系統發育學分析

對菌株130 的16S rRNA 基因序列的相似性進行比較，見圖1。

圖1 菌株130 和相關菌株序列的16S rRNA 基因序列的鄰接法系統發育樹Fig.1 Phylogenetic tree showing the relationships of strain 130 with the related species constructed by the neighbour-joining method and based on 16S rRNA gene sequences.(結點處數字為bootstrap 值括號內為序列登錄號)

結果表明：菌株130 的序列與Bacillus hwajinpoensis SW-72（AF541966）的同源性為99%。從圖1 系統進化樹可見，菌株130 屬于芽孢桿菌目（Bacillales），芽孢桿菌科（Bacillaceae），芽孢桿菌屬（Bacillus）。Bacillus是深海環境中常見的微生物物種，能分泌許多活性物質，如新型低溫酶類、具有新穎結構的先導化合物等[4]。關于此屬菌株能夠產低溫脂肪酶的研究報道較少。

2.3 部分酶學特性

溫度是影響酶促反應的重要因素。在0 ℃～60 ℃范圍內測定酶活力隨溫度的變化情況見圖2。

圖2 溫度對脂肪酶活性的影響Fig.2 Effect of temperature on the activity of the lipase

結果表明，該脂肪酶最適作用溫度為35 ℃，在0 ℃可保持約33%的相對酶活力。Rashid 等（2001）報道的深海適冷假單胞菌（Pseudomonas sp.）KB700A 所產低溫脂肪酶的最適酶活溫度也為35 ℃[5]。據Margesin 的定義[6]，通常把最適催化溫度在35 ℃左右、在0 ℃左右仍有一定催化效率的酶，稱為低溫酶。這表明該菌株分泌的胞外脂肪酶屬于低溫脂肪酶，有望應用于低溫環境工業下的生物催化。

pH 對脂肪酶活性的影響見圖3。

圖3 pH 對脂肪酶活性的影響Fig.3 Effect of pH on the activity of the lipase

菌株130 所產低溫脂肪酶在pH 5～7 的范圍內均存在著較高酶活力，最適pH 為6.0，在pH 為9.0～11.0時，幾乎沒有酶活。可見該脂肪酶為酸性脂肪酶，這與大多數低溫脂肪酶的最適pH 8.0～9.0 有顯著區別[7-8]。這種特殊的酶學特性將在工業上有廣泛應用前景。

脂肪酶的熱穩定性的實驗見圖4。

圖4 表明，30 ℃和40 ℃對酶活性影響不大，但隨著處理溫度的升高，熱穩定性較差，該酶半衰期為50 ℃保溫10 min，60 ℃下保溫10 min 后酶活性下降了70 %，該酶對熱較為敏感，是長期低溫生活對環境的一種適應，也是低溫酶的一個重要特征。

脂肪酶對金屬離子的影響情況列于表1 中。

EDTA 對脂肪酶活性沒有影響，表明該酶的催化作用不需要金屬離子的參與；某些金屬離子的存在會微弱抑制酶活，如Mg2+、Fe2+、Ca2+和K+，但Cu2+和Zn2+存在的條件下，酶活降至對照的19.20%、28.29%。

3 結論

本文從鄂霍次克海域深海微生物中篩選到產脂肪酶活性較高的菌株130，經16S rRNA 分子鑒定為Bacillus sp.130。該菌株分泌的胞外脂肪酶是一種新型的低溫酸性脂肪酶，其最適作用溫度在35 ℃左右，在0 ℃可保持33%的相對酶活力，最適作用pH 6.0，相對于中溫脂肪酶最適作用溫度較低，最適作用pH 偏酸性，因此在食品、輕化工和醫藥等領域有良好的應用前景。

表1 金屬離子對脂肪酶活性的影響Table 1 Effect of metal ions on the activity of the lipase

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