超聲波法提取益母草中多糖方法的研究

張金生，楊宏娟，李麗華，趙文濤，蔚永清

（1.遼寧石油化工大學化學與材料科學學院，遼寧撫順 113001；2.遼寧石油化工大學石油化工學院，遼寧撫順 113001）

益母草（Leonurus Japonicus Houtt），別名茺蔚、坤草，是一種草本植物，以花蕾期的地上部分的干品或鮮品入藥，有活血調經，祛瘀生新，利尿消腫等功效，臨床多用于月經不調、胎漏難產、痛經及產后瘀血腹痛，素有“血家圣藥”、“經產良藥”之稱[1]。目前對益母草中化學成分研究較多的主要是生物堿、二萜類、阿魏酸類、揮發油類等[2]。而對益母草多糖研究較少，多糖（polysaccharide）是構成生命的四大基本物質之一，多糖在增強免疫力、降血糖、抗腫瘤、抗炎、抗病毒、抗衰老、抗凝血等方面發揮著生物活性作用[3]。因此，隨著多糖的制備、合成、食品科學及藥理學研究的不斷深入，多糖的應用將具有更廣闊的前景[4]。本試驗優化了益母草多糖的提取工藝，以其為更好的利用益母草提供參考。

1 材料和儀器

1.1 實驗原料和試劑

益母草：采自撫順市千金鄉。乙醇、葡萄糖、正丁醇、氯仿、濃硫酸、苯酚等均為分析純試劑。

1.2 儀器

超聲波清洗器：天津市琛航科技儀器有限公司；可見分光光度計：上海達平儀器有限公司；遠紅外輻射干燥箱：上海陽光實驗儀器有限公司；低速離心機：北京醫用離心機廠。

2 方法

2.1 超聲波提取益母草多糖

稱取1 g益母草粉末，放入錐形瓶中，利用超聲波提取，冷卻，布氏漏斗過濾，棄去濾渣，用旋轉蒸發儀使濾液濃縮，用Savage法除蛋白，向濃縮液中加入氯仿和正丁醇的混合液（體積比為4∶1），反復強烈振蕩，直到在280 nm處沒有紫外吸收峰為止，加入3倍體積的95%乙醇溶液，靜置過夜，4000r/min離心20 min，無水乙醇、丙酮洗滌至無色，烘干，得益母草粗多糖。

2.2 樣品多糖含量的測定

本實驗采用苯酚－硫酸法測定多糖含量。稱取樣品多糖5mg至50mL的容量瓶中配置成0.1mg/mL的多糖溶液，按照2.1的方法測其吸光度值，并通過運用線性回歸方程計算其對應的多糖濃度，進而利用多糖的計算公式求出多糖的得率。計算公式如下：

式中:C為多糖質量濃度，（mg/mL）；D為稀釋倍數；V為體積，mL；M為多糖的總質量，mg；m為配制樣品溶液的多糖質量，mg；W為原藥材質量，g。

3 結果與討論

3.1 標準曲線的繪制

準確稱取干燥至恒重的葡萄糖0.100 2 g，加蒸餾水定容在100 mL的容量瓶中，分別移取0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL至25 mL的容量瓶中，加入蒸餾水至刻度搖勻，再分別移取1 mL于具塞試管中，加入1 mL 6%的苯酚，并迅速滴加濃硫酸6 mL，沸水加熱30 min，冷卻至室溫，同時用蒸餾水做空白試驗。在492 nm處測定吸光度A，以葡萄糖濃度（mg/mL）為橫坐標，吸光度A為縱坐標，可得回歸方程為：y=0.124x-0.006 4，R2=0.999 6。

圖1 葡萄糖標準曲線Fig.1 The standard curve of the glucose

3.2 超聲波法提取益母草中多糖的單因素試驗

3.2.1 提取時間對多糖提取率的影響

稱取益母草樣品0.5 g，料液比為1∶15（g/mL），溫度35℃，提取益母草多糖時間分別為5、10、15、20、25 min，結果如圖 2 所示。

圖2 提取時間對多糖得率的影響Fig.2 Effects of the extraction time on extraction rate

由圖2可知，多糖得率隨著提取時間增長而增大，當時間達到15 min時得率最大，之后時間越長得率反而減少，這可能是由于長時間的超聲提取不能使多糖完全溶出，但由于超聲波對多糖的機械效應，時間過長會破壞多糖的結構，影響多糖的得率。

3.2.2 料液比對多糖提取率的影響

稱取益母草樣品 0.5 g，料液比為 1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30（g/mL），溫度 35 ℃，提取益母草多糖15 min，結果如圖3所示。

圖3 料液比對多糖得率的影響Fig.3 Effects of the solid to liquid on extraction rate

由圖3可知，多糖的得率隨著料液比的增大而增加，當料液比達到 1∶15（g/mL）時得率最大，之后料液比越大多糖得率反而下將。可能是溶劑量過小時，多糖溶出不完全；溶劑量過大時，超聲波輻射又被溶液大量吸收，不能完全作用于物料，從而影響多糖提取率[5]。

3.2.3 溫度對多糖提取率的影響

稱取益母草樣品 0.5 g，料液比為 1∶15（g/mL），溫度 15、25、35、45、55 ℃，提取益母草多糖 15 min，結果如圖4所示。

圖4 提取溫度對多糖得率的影響Fig.4 Effects of the extraction on extraction rate

由圖4可知，多糖得率隨著溫度的升高而增大，當溫度達到55℃時多糖得率最大，之后隨著溫度繼續增高得率反而減少，可能是由于植物多糖不易溶于低溫的水，而溫度過高會使多糖水解變質，從而影響得率。

3.3 正交試驗設計及結果分析

為了優化提取工藝，本試驗通過對單因素的考察，選擇了對提取率影響較大的3個因素：提取時間（A）、料液比（B）、反應溫度（C），進行三因素三水平的正交試驗。由多糖得率為試驗指標來確定最佳的提取工藝。正交試驗因素水平如表1，正交試驗結果如表2。

表1 正交試驗因素水平Table 1 Factors and levels of orthogonal test

由表2中的極差分析可知，影響益母草多糖得率的順序為B＞A＞C，即料液比＞提取時間＞提取溫度。由正交試驗結果可知最佳的提取工藝條件為A2B2C2，即提取時間為 15 min，料液比為 1∶15（g/mL），提取溫度為35℃。

表2 正交試驗結果及直觀分析Table 2 The test resulst and the visual analysis of the orthogonal test

3.4 最佳工藝條件的驗證

按A2B2C2組合進行5次平行試驗，提取率為3.24%。再按A3B2C3組合進行5次平行試驗，提取率為3.11%。由此可知，超聲波法提取益母草中多糖最佳的提取工藝為A2B2C2，即提取時間為15 min，料液比為 1∶15（g/mL），提取溫度為 35 ℃。

3.5 穩定性試驗

稱取1 mL的樣品溶液，按2.1法每隔半個小時（30 min）測定一次吸光度，結果如表3所示，RSD為0.34%。

表3 穩定性試驗結果Table 3 The test results of the stability

3.6 精密度試驗

稱取1 mL相同的樣品溶液5份，按2.1法測得樣品的吸光度值，結果如表4所示，其RSD為0.39%。

表4 精密度試驗結果Table 4 The test results of the precision

3.7 加標回收率試驗

精密稱取益母草粗多糖5份，加入與測得多糖的含量相近的葡萄糖粉末，按2.1法得樣品的吸光度值，計算出平均加標回收率為93.04%，RSD為2.03%，結果如表5所示。

表5 加標回收率試驗結果（n=5）Table 5 The test results of the recovery（n=5）

4結論

采用超聲波法提取益母草多糖并通過正交試驗設計優化益母草多糖的提取工藝，其最佳提取工藝為提取時間15 min，料液比1∶15，提取溫度35℃，在最佳工藝條件下的提取率為3.24%。比文獻[6]報道益母草多糖的提取率低了1.62%，但是提取時間縮短了7倍。由于益母草價格低廉、易得，同時具有一定的藥理作用，且此方法方便、簡單快捷、不引進雜質，為益母草的進一步開發利用提供了參考。

采用苯酚－硫酸法測定益母草中多糖的含量，根據多糖在有濃硫酸的條件下先水解成單糖，同時迅速脫水生成糖醛衍生物，然后與苯酚生成糖醛衍生物，此物質在波長480 nm～490 nm處吸光度值與糖濃度呈一定的線性關系，從而得出多糖濃度。此方法的試劑易得、簡便快捷，同時益母草多糖在此法顯色后3 h內穩定、回收率高。

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[1]安偉建.中藥益母草有效成分提取和測定方法的研究進展[J].天津藥學,2003,15(3):68－70

[2]范美華,王健鑫,李鵬,等.益母草的研究進展[J].中國藥物與臨床,2006,6(7):528－530

[3]周萍,王成軍,張海珠.西歸中多糖的提取及含量測定[J].時珍國醫國藥,2010,21(9):2210－2211

[4]賈亮亮,袁丁,何毓敏,等.多糖提取分離及含量測定的研究進展[J].食品研究與開發,2011,32(3):189－192

[5]禹文峰,任風蓮,吳曉斌.百合多糖的超聲波提取工藝研究[J].廣州化學,2007,32(2):36－40

[6]蔡文燕,吳水金,蔡欣.益母草多糖提取工藝的研究[J].熱帶農業科學,2008,28(6):39－42