利用響應(yīng)面分析法進(jìn)行氨肽酶發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化

楊玉蘭，楊萍，姜文俠，*，劉琦，周賀，梅保良

（1.天津科技大學(xué)，天津300457；2.天津市工業(yè)生物系統(tǒng)與過程工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，中國(guó)科學(xué)院系統(tǒng)微生物工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，中國(guó)科學(xué)院天津工業(yè)生物技術(shù)研究所，天津300308）

氨肽酶（aminopeptidase）是蛋白水解酶中外肽酶的一類，它們能從蛋白質(zhì)和多肽鏈的N 末端順序水解氨基酸。甲硫氨酸氨肽酶是氨肽酶中的一種，在蛋白質(zhì)加工過程中負(fù)責(zé)切除新生肽鏈N 端的起始甲硫氨酸[1]。目前氨肽酶制劑主要應(yīng)用于功能肽的制備和蛋白質(zhì)水解食品的生產(chǎn)加工過程，用以提高營(yíng)養(yǎng)質(zhì)量，改善產(chǎn)品的最終風(fēng)味[2]。甲硫氨酸氨肽酶特有的水解方式和功能，決定了其廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、發(fā)酵、飼料及生物技術(shù)等行業(yè)[3-6]。我國(guó)的微生物氨肽酶研究工作處于實(shí)驗(yàn)室階段，氨肽酶菌種發(fā)酵單位低，難以達(dá)到工業(yè)化生產(chǎn)的要求，而菌種是工業(yè)發(fā)酵生產(chǎn)外肽酶的重要條件。從自然界篩選并在實(shí)驗(yàn)室誘變進(jìn)化一直是發(fā)現(xiàn)和創(chuàng)新工業(yè)微生物菌種的重要途徑。本實(shí)驗(yàn)從傳統(tǒng)食品麥醬中篩選得到一株甲硫氨酸氨肽酶生產(chǎn)菌11-11-16-2-4AL，在對(duì)其發(fā)酵特性研究的基礎(chǔ)上，研究了發(fā)酵生產(chǎn)氨肽酶的工藝參數(shù)。

Plackett-Burman 設(shè)計(jì)法是一種兩水平的試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法，它試圖用最少試驗(yàn)次數(shù)達(dá)到使因素的主效果得到盡可能精確的估計(jì)，適用于從眾多的考察因素中快速有效地篩選出最為重要的幾個(gè)因素，供進(jìn)一步研究[9]。響應(yīng)面分析法是一種尋找多因素系統(tǒng)中最佳的數(shù)學(xué)統(tǒng)計(jì)方法，可以通過擬合方程的方法得到顯著影響因素的最佳水平組合[10]。但是響應(yīng)面擬合方程只在考察區(qū)域的緊鄰范圍內(nèi)才充分近似真實(shí)情形，所以，要先接近最佳值區(qū)域后才能建立有效的響應(yīng)面擬合方程。最陡爬坡法是尋找最優(yōu)區(qū)域的一個(gè)有效的方法，它可以將顯著因素的水平逼近最優(yōu)區(qū)域。這種方法可以迅速搜索到關(guān)鍵因子的極值點(diǎn)。快速登高法縮短了實(shí)驗(yàn)的路徑，能以較少的實(shí)驗(yàn)次數(shù)快速逼近最優(yōu)值區(qū)域[11]。

本文以甲硫氨酸氨肽酶生產(chǎn)菌的發(fā)酵酶活水平作為響應(yīng)目標(biāo)，在培養(yǎng)基成分單因素優(yōu)化的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步采用Plackett-Burman、最陡爬坡、響應(yīng)面的Box-Benhnken 的中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，通過Minitab 軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，擬合數(shù)學(xué)模型，尋求最優(yōu)培養(yǎng)基配方，并進(jìn)行驗(yàn)證。研究中的試驗(yàn)設(shè)計(jì)、數(shù)據(jù)分析及模型建立皆由Minitab 軟件輔助完成。

1 材料與方法

1.1 菌種和培養(yǎng)基

甲硫氨酸氨肽酶產(chǎn)生菌11-11-16-2-4AL，為本實(shí)驗(yàn)室從麥醬中分離。

種子培養(yǎng)基（g/L）：麥芽糊精8，酵母粉2，蛋白胨8，磷酸二氫鉀1，硫酸鎂0.2，pH 7.2，121 ℃滅菌20 min。

發(fā)酵培養(yǎng)基（g/L）：麥芽糊精15，酵母粉10，蛋白胨5，牛肉膏2，磷酸二氫鉀2.7，硫酸鎂0.1，氯化鈉1，pH 7.2，121 ℃滅菌20 min。

1.2 主要試劑和儀器

甲硫氨酸對(duì)硝基苯胺：sigma 公司，分析純；其它均為市售分析純。

TU-1810PC 型紫外分光光度計(jì)：北京普析通用；IS-RDH1 型臥式恒溫振蕩器：美國(guó)精騏；電熱恒溫水浴鍋：天津泰斯特；Thermo CR3i高速冷凍離心機(jī)：美國(guó)賽默飛世爾科技。

1.3 培養(yǎng)方法

挑取氨肽酶產(chǎn)生菌11-11-16-2-4A 的單菌落接入種子培養(yǎng)基中，于36 ℃搖床200 r/min 培養(yǎng)6 h～8 h，制備種子液。將種子液按5 %接種量，接種至發(fā)酵培養(yǎng)基，于36 ℃搖床200 r/min 培養(yǎng)24 h，為甲硫氨酸氨肽酶的發(fā)酵液。將發(fā)酵液于4 ℃、10 000 r/min 離心得上清液，即為甲硫氨酸氨肽酶的粗酶液，最后對(duì)粗酶液進(jìn)行酶活測(cè)定。

1.4 酶活檢測(cè)方法

常規(guī)對(duì)硝基苯胺法[7-8]：向比色管中加入2 mL氨-氯化銨緩沖液和1 mL 底物溶液，再加入l mL 稀釋一定倍數(shù)的粗酶液，60 ℃水浴反應(yīng)10 min，反應(yīng)結(jié)束立即加入終止液6 mL，終止反應(yīng)。空白對(duì)照以蒸餾水代替粗酶液。以紫外分光光度計(jì)于380 nm測(cè)定吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算酶活。酶活定義：60 ℃每分鐘水解甲硫氨酸對(duì)硝基苯胺產(chǎn)生1 μmol對(duì)硝基苯胺所需的酶量，定義為一個(gè)酶活單位（U）。

2 結(jié)果與分析

2.1 Plackett-Burman 設(shè)計(jì)試驗(yàn)確定顯著因素

在培養(yǎng)基成分單因素優(yōu)化的基礎(chǔ)上，將原發(fā)酵培養(yǎng)基的7 種成分麥芽糊精、酵母粉、蛋白胨、牛肉膏、磷酸二氫鉀、硫酸鎂和氯化鈉，分別作為Plackett-Burman 設(shè)計(jì)的7 個(gè)因素A、B、D、E、G、H、K，另設(shè)2 個(gè)虛擬因素C 和F，以考察試驗(yàn)誤差。每個(gè)因素取2 個(gè)水平，低水平為原發(fā)酵培養(yǎng)基水平，高水平取低水平的1.2 倍。并運(yùn)用Minitab 軟件進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)，每個(gè)試驗(yàn)重復(fù)2 次，對(duì)應(yīng)的響應(yīng)值取2次試驗(yàn)結(jié)果的平均值，試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表1。

從表1 可知，在這7 個(gè)因素的主效應(yīng)中，B、D、E和G 對(duì)響應(yīng)值（酶活）表現(xiàn)為負(fù)效應(yīng)，A、H、J 對(duì)響應(yīng)值（酶活）表現(xiàn)為正效應(yīng)。其中A、B、D 對(duì)響應(yīng)值（酶活）有顯著影響（可信度大于95%，即主效應(yīng)p＜0.05），作為顯著因素進(jìn)行下一步試驗(yàn)。

2.2 最陡爬坡法逼近顯著因素最優(yōu)區(qū)域

根據(jù)Plackett-Burman 試驗(yàn)結(jié)果，確定各因素的水平。由于E 和G 對(duì)酶活表現(xiàn)為負(fù)效應(yīng)，所以確定E 和G 的添加量分別為：2、2.5 g/L；H、J 對(duì)酶活表現(xiàn)正效應(yīng)，所以確定H、J 的添加量為6、1.2 g/L。顯著因素A 對(duì)酶活表現(xiàn)正效應(yīng)、B 和H 對(duì)酶活表現(xiàn)為負(fù)效應(yīng)，故應(yīng)該適當(dāng)提高A 的濃度，降低B 和H 的濃度。根據(jù)3 個(gè)顯著影響因素效應(yīng)的大小確定快速登高試驗(yàn)的方向和變化步長(zhǎng)，以最快的速度逼近最大響應(yīng)值（酶活）的區(qū)域，試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見表2。

表1 Plackett-Burman 試驗(yàn)設(shè)計(jì)、相應(yīng)值及結(jié)果分析Table 1 Experimental design，responses and results analysis of PB design

表2 快速登高試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 2 Design and result of the steepest ascent experiment

由表2 可知，顯著因素濃度在編號(hào)為3 試驗(yàn)的條件下，酶活最高。故以編號(hào)3 的條件作為響應(yīng)面設(shè)計(jì)因素水平的中心點(diǎn)。即麥芽糊精、酵母粉和硫酸鎂的濃度分別為30、6、0.24 g/L。

2.3 響應(yīng)面法優(yōu)化甲硫氨酸氨肽酶的發(fā)酵培養(yǎng)基

2.3.1 響應(yīng)面設(shè)計(jì)與結(jié)果

根據(jù)響應(yīng)面的Box-Benhnken 的中心組合設(shè)計(jì)原理，以酶活為影響值，設(shè)計(jì)三因素三水平共15 個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)的響應(yīng)面分析試驗(yàn)，其中12 個(gè)是析因點(diǎn)，三個(gè)位零點(diǎn)重復(fù)，零點(diǎn)試驗(yàn)重復(fù)三次，用以估計(jì)試驗(yàn)誤差。響應(yīng)面設(shè)計(jì)的因素與水平取值見表3，試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見表4。

表3 響應(yīng)面設(shè)計(jì)的因素編碼與水平取值Table 3 The factor codes and levers of experiment of the RSM

表4 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 4 Design and result of the Response Surface Methodology experiment

2.3.2 二次回歸擬合及方差分析

以酶活為響應(yīng)值，運(yùn)用Minitab 軟件進(jìn)行回歸擬合，得到回歸方程：Y=44.726 7-7.998 75X1-4.957 5X2-7.703 75X3-11.897 1X1X1-11.234 6X2X2-10.092 1X3X3+3.420X1X2+7.057 5X1X3+1.61X2X3。運(yùn)用Minitab 軟件對(duì)回歸方程進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表5。

表5 回歸方程的方差分析Table 5 Variance analysis of regression equation

由表5 可知，經(jīng)F 檢驗(yàn)，回歸方程一次項(xiàng)、二次項(xiàng)顯著，回歸模型P 值=0.008，離回歸偏差S=5.131 22，決定系數(shù)R2＝0.952 2，說明此模型的可信度較高，關(guān)于甲硫氨酸氨肽酶的回歸方程的擬合程度較好。

2.3.3 響應(yīng)面分析及最優(yōu)培養(yǎng)基成分的確定

對(duì)回歸模型進(jìn)行規(guī)范分析，結(jié)合Matlab 軟件作出響應(yīng)面分析圖及等高線圖，如圖1 所示。

每個(gè)響應(yīng)面分別代表2 個(gè)獨(dú)立變量之間的相互作用。由響應(yīng)面和相應(yīng)的等高線可以看出，兩兩因素之間的相互作用比較明顯。經(jīng)過Matlab 分析，確定三個(gè)因素的最優(yōu)試驗(yàn)點(diǎn)（X1，X2，X3）=（-0.567，-0.350，-0.608），代入回歸方程，解得預(yù)測(cè)的甲硫氨酸氨肽酶的酶活為50.20 U/mL，根據(jù)三因素的取值，經(jīng)過換算，得出三因素的最佳取值分別為X1=26.00 g/L，X2=5.3 g/L，X3=0.204 g/L。

為了證實(shí)預(yù)測(cè)的結(jié)果，用所得到的最優(yōu)培養(yǎng)基配方進(jìn)行三次重復(fù)發(fā)酵試驗(yàn)，所測(cè)得的甲硫氨酸氨肽酶活分別為49.87、50.89、51.78 U/mL，平均值50.84 U/mL，預(yù)測(cè)值與試驗(yàn)值相差極小，說明該模型能夠較好地預(yù)測(cè)實(shí)際發(fā)酵情況。

3 結(jié)論

借助Minitab 軟件能方便地應(yīng)用PB 設(shè)計(jì)和響應(yīng)面分析法進(jìn)行合理的試驗(yàn)安排和數(shù)據(jù)分析，并利用該軟件作出響應(yīng)面分析圖及等高線圖得到了甲硫氨酸氨肽酶的最佳發(fā)酵培養(yǎng)基：麥芽糊精26 g/L，酵母粉5.3 g/L，蛋白胨6 g/L，牛肉膏2 g/L，磷酸二氫鉀2.5 g/L，硫酸鎂0.204 g/L，氯化鈉1.2 g/L，pH 7.2。在此條件下對(duì)預(yù)測(cè)結(jié)果進(jìn)行了驗(yàn)證，得到甲硫氨酸氨肽酶的酶活為50.84 U/mL，與優(yōu)化前24.06 U/mL 相比，提高了1.11 倍，且預(yù)測(cè)值與試驗(yàn)值相差極小，表明該模型能夠較好地預(yù)測(cè)實(shí)際發(fā)酵情況，適合多因素的發(fā)酵條件優(yōu)化。

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