醇析法結合離子交換法提取分離卵轉鐵蛋白

張晴晴，侯惠靜，劉愛國，張佳慧，帖航，吳子健

（天津商業大學生物技術與食品科學學院，天津市食品生物技術重點實驗室，天津300134）

卵轉鐵蛋白（Ovotransferrin，OVT）又稱副卵白蛋白或卵伴白蛋白，是禽蛋清中一種含686 個氨基酸殘基的單肽鏈糖蛋白，其約占雞蛋蛋清蛋白總量的12%。該蛋白分子質量為78 ku～80 ku，pI 為6.0，天然狀態下，其分子中所含的半胱氨酸殘基均參與形成穩定蛋白結構的二硫鍵，總共有15 個二硫橋鍵[1]。可結合鐵、銅、鋅等金屬離子，具抗細菌、抗真菌、抗病毒活性以及提高免疫力等生理功能。在制藥工業和食品工業極具有廣泛的應用前景。

目前國內外用于提取制備卵轉鐵蛋白方法有鹽沉淀法、膜分離技術法、陰陽離子樹脂交換法以及乙醇析出法，但提取蛋白的純度較低；也有固定化金屬螯合親和色譜法產量雖有所提高，但過程較為復雜，且產量也較低。本文主要研究醇析法結合弱酸性陽離子交換法提取分離卵轉鐵蛋白的工藝條件，目的在于既提高卵轉鐵蛋白制備的產量，又有效提高產品的純度。

1 材料與方法

1.1 卵轉鐵蛋白制備工藝路線

原蛋清→蛋清預處理→兩步醇析→兩步弱酸性陽離子層析→透析除鹽→冷凍干燥→產品

1.2 材料及儀器

新鮮雞蛋：超市購買；其他試劑均為國產分析純；3-18K 低溫高速離心機：德國Sigma 公司；FDU-810 型EYELA 冷凍干燥機：日本東京理化公司；JY-SCZ2+型電泳槽、JY600 型電泳儀：北京君意東方電泳設備有限公司；WFZ800-D3B 紫外可見分光光度計：北京瑞利分析儀器公司；AUW120D 電子天平：SHIMADZU 公司；Bio-rad 凝膠電泳成像儀：bio-rad laboratories-Segrate Milan ltaly。

1.3 方法

1.3.1 蛋白質濃度的測定[2]

采用考馬斯亮藍法測定所提取樣品的蛋白質濃度。

1.3.2 蛋白質的SDS-PAGE 電泳[3]

SDS-PAGE 電泳檢測蛋白質樣品條件：12%的分離膠和5 %的濃縮膠，上樣量10 μL，蛋白質濃度為1 mg/mL，200 V 恒壓電泳1 h。

1.3.3 蛋清的預處理[4-5]

蛋清預處理參照2001年Thomas Croguennec 等和2005年C Guérin-Dubiard 等的方法并稍加改進。取新鮮雞蛋，手工分離得到蛋清，加入3 倍去離子水混勻稀釋，6 層紗布過濾除去不溶性物，濾液用1 mol/L HCl調pH 至6.0，4 ℃下攪拌過夜，之后置于4 ℃下3 000×g離心5 min。離心后，上清液即為“無黏蛋白”蛋清（“mucin-free”EW）。

1.3.4 乙醇析出法提取卵轉鐵蛋白粗品[6]

將經1.3.3 法預處理后的蛋清的pH 調節至pH9.0，按照2008年K.Y.Ko 等的方法，采用乙醇析出法提取卵轉鐵蛋白粗品，方法簡要如下：將經1.3.3 法預處理好的蛋清溶液pH 調節至9.0，加入NaHCO3、NaCl 和FeCl3至終濃度分別為50 mmol/L、150 mmol/L和20 mmol/L，攪拌30 min 并加入乙醇至終濃度為43%（體積分數）后離心（4 ℃，3 220 g，20 min）取上清再滴加乙醇至終濃度為59 %，室溫下攪拌30 min 后離心（4 ℃，3 220 g，20 min）取沉淀復溶于檸檬酸鹽緩沖液（50 mmol/L）中并調節pH 至4.7，再加入已處理的pH 為4.7 的陽離子樹脂并室溫下攪拌3 h，過濾出去樹脂，濾液凍干得OVT 粗品。

1.3.5 兩步弱酸性陽離子交換層析法進一步純化卵轉鐵蛋白[7]

參照2005年C Guérin-Dubiard 等的方法進行離子交換層析，略有改進，具體如下：經1.3.4 法提取的卵轉鐵蛋白粗品用磷酸緩沖液（pH8.0、20 mmol/L）溶解，至終濃度50 mg/mL，并用NaOH（1.0 mol/L）調節pH 至8.0，蛋白溶液經低溫離心（4 ℃、6 000 g、30 min）得到蛋白濾液再經兩步離子交換層析：第一步為pH8.0 弱酸性陽離子樹脂去除堿性蛋白（緩沖液為：pH8.0 20 mmol/L 磷酸緩沖液；洗脫液為：0.5 mol/L NaClpH8.0 20 mmol/L 磷酸緩沖液；流速為20 mL/min；柱子25 cm×3 cm）收集峰1 組分；第二步為pH5.2 弱酸性陽離子樹脂提取卵轉鐵蛋白粗品（緩沖液為：pH5.2 10 mmol/L 檸檬酸鹽緩沖液；洗脫液為：0.5 mol/L NaCl-pH5.2 10 mmol/L 檸檬酸鹽緩沖液；流速為20 mL/min；柱子25 cm×3 cm），收集峰2 組分含有卵轉鐵蛋白，再經透析除鹽（4 ℃，24 h）就會得到高純度的產品，最后進行電泳檢測。

2 結果與分析

2.1 乙醇析出法提取卵轉鐵蛋白粗品的結果

堿性條件下（pH=9.0）并有伴陰離子（HCO3-）的存在下，OVT 可通過HCO3-與Fe3+形成三元復合體，即Fe3+2-HCO3-OVT 復合物，呈橙紅色。OVT 蛋白分子中的N-端瓣和C-端瓣各含有一個金屬結合位點[8]，其中N-端瓣中的4 個氨基酸殘基（即Asp60、Tyr191、Tyr92和His250）與來自伴陰離子的HCO3-共擁有6 個可與Fe3+結合的配位鍵，同樣C-端瓣的Asp395、Tyr524、Tyr431 和His592 也與來自一個HCO3-離子擁有6 個可與Fe3+結合的配位鍵，從而形成了2 個金屬結合位點。OVT 蛋白與HCO3-以及Fe3+相互結合后會使整個蛋白分子結構變得更緊密、封閉、穩定，并且提高了其對乙醇沉淀作用的耐受性。

方法1.3.4 先形成了OVT-HCO3－-Fe3+三元復合體，后在43%乙醇濃度下，稀釋后的蛋清液中幾乎除了OVT 蛋白的其他蛋白都會沉淀，經4 ℃離心（3 220×g，20 min）后可除去大部分除了轉鐵蛋白雜蛋白，而大部分形成三元復合體的OVT 則存在于呈亮橙紅色的上清液中，但當乙醇終濃度到了59%時，溶液中橙紅色物質，即OVT 三元復合體會發生沉淀，沉淀再用去離子水復溶成為亮橙紅色溶液，調節此溶液pH 至4.7，此時三元復合體在酸性條件下穩定性下降，HCO3-和Fe3+會游離出來，溶液顏色會由亮橙紅色逐漸變為乳白色，再加入陰離子交換樹脂并經攪拌，HCO3-被陰離子交換樹脂吸附，經過濾后，結合了HCO3-的樹脂可被除去，此時，脫輔基蛋白就不會再結合Fe3+。得到溶液經透析，凍干，得到脫輔基的卵轉鐵蛋白。SDS-PAGE電泳得到的電泳圖如圖1 所示。表明，此時蛋白的純度較高，經凝膠成像系統的軟件分析表明該蛋白的純度高于96%。

注：5%濃縮膠、12%分離膠；A 電泳道為Marker（PageRuler Prestained Protein Ladder#Sm0672，Fermentas 公司），上樣量5 μL；B 和C 電泳道分別為2 次提取的OVT 樣品，濃度為1 mg/mL、上樣量10 μL。

注：a 圖中，層析柱：2.0 cm×4 cm、平衡緩沖液：pH5.2，0.05 mol/L 檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液、流速：1 mL/min、洗脫液：0.05 mol/L 檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液pH5.2 并含0.5 mol/L NaCl；b 圖中，A 電泳道為組分1的圖譜，B 電泳道為組分2 的圖譜，C 電泳道為蛋白質marker。

從電泳圖譜的結果來看，由方法1.3.4 提取的OVT 蛋白粗品仍含有其他蛋白質，特別是分子量在72 ku～34 ku 范圍內的其他蛋白。

2.2 兩步弱酸性陽離子交換層析進一步純化卵轉鐵蛋白的結果

第一步弱酸性陽離子交換層析過程如圖2a 所示，峰1 處所收集的蛋白液含有OVT 蛋白的組分1，峰2處所收集的為含有溶菌酶以及抗生素蛋白的組分2，經SDS-PAGE 電泳的檢測結果如圖2b 所示，經過這一步離子交換步驟，可有效地將等電點≥8.0 雜蛋白從樣液中除去。

3 結論

雞蛋原蛋清經過蛋清預處理后可以得到“無黏蛋白”被稀釋的蛋清液，再經過兩步醇析法可以得到純度較高的卵轉鐵蛋白，最后的兩步弱酸性陽離子層析法以及相應的冷凍干燥可是得到純度高于96%的卵轉鐵蛋白產品。

注：a 圖中，層析柱：2.0 cm×4 cm、平衡緩沖液：pH8.0，0.05 mol/L 磷酸鹽緩沖液、流速：1 ml/min、洗脫液：0.05 mol/L 磷酸鹽緩沖液pH8.0 并含0.5 mol/LNaCl；b 圖中，A 電泳道為組分1 圖譜，B 電泳道為組分2圖譜。

第二步弱酸性陽離子交換層析過程如圖3 所示，峰1 處所收集的組分1 蛋白液所含的大多數蛋白質的等電點小于pH5.2，而峰2 處所收集的組分2 蛋白液為OVT 蛋白組分，經SDS-PAGE 電泳的檢測結果如圖2b 所示，經過第二步離子交換后，B 電泳道的圖譜

[1] Spik G,Coddeville B,Montreuil J.Comparative study of the primary structures of sero-,lacto-and ovotransferrin glycans from different species[J].Biochimie,1988,70(11):1459-1469

[2] 陳慶森,龐光昌,吳子健.實用生物化學實驗技術指導[M].天津:天津科學技術出版社,2006:40-41

[3] 理查德J 辛普森.蛋白質與蛋白質組學實驗指南[M].何大澄,譯.北京:化學工業出版社,2006:35-79

[4] Guérin-Dubiard C,Pasco M,Hietanen A.Hen egg white fractionation by ion-exchange chromatography [J].Journal of Chromatography A,2005(6):58-67

[5] Thomas Croguennec,Fran?oise Nau,Stéphane Pezennec,et al.Twostep chromatographic procedure for the preparation of hen egg white ovotransferrin[J].Eur Food Res Technol,2001,212(15):296-301

[6] Ko K Y,Ahn D U.An Economic and Simple Purification Procedure for the Large-Scale Production of Ovotransferrin from Egg White[J].Poultry Science,2008(87):1441-1450

[7] C Guérin-Dubiard,M Pasco,A Hietanen.Hen egg white fractionation by ion-exchange chromatography[J].Journal of Chromatography A,2005,1090(1-2):58-67

[8] Hirofumi Kurokawa, Bunzo Mikami, Masaaki Hirose. Crystal Structure of Diferric Hen Ovotransferrin at 2.4?Resolution[J].J Mol Biol,1995,254(2):196-207