香樟葉葉綠素的提取及穩定性研究

孫崇魯

（浙江醫藥高等專科學校，浙江寧波315100）

樟樹系樟樹屬的常綠喬木植物，是我國亞熱帶綠闊葉林的主要樹種之一，它在我國資源豐富。樟樹具有驅蟲、防腐耐蛀的功能。樟樹葉有提取色素、香料等用來制成植物農藥，制備氧化劑和醫藥產品等。且樟樹葉為可再生資源，其應用前景廣闊[1]。植物中葉綠素含量是植物生理生化及生態調查中的一個重要測量參數，它不僅是表達植物生物量的一個指標，也是檢測植物健康程度及環境因子的關鍵指標[2]。葉綠素作為一種天然色素廣泛應用于醫藥、食品、化妝品等行業[3-5]，隨著人們生活水平的提高，對天然色素的需求量也日趨增長。本試驗對香樟葉葉綠素提取工藝進行優化，并對其穩定性進行了初步研究，旨在為香樟葉葉綠素的提取和香樟葉綜合開發利用提供理論參考。

1 主要儀器與試劑

UVmini-1240 型紫外可見分光光度計：島津（中國）有限公司，香樟葉采自浙江醫藥高等專科學校校內，丙酮、乙醚、乙醇、石油醚、氯仿、甲醇、抗壞血酸等均為分析純。

2 方法

2.1 葉綠素提取的工藝流程[6-7]

香樟葉→洗凈→吸干表面水分→剪碎→稱量→浸提→離心→測吸光度值

2.2 單因素試驗

[8-9]的方法，分別對香樟葉葉綠素提取過程中所用的提取劑、提取劑濃度、提取時間、料液比、提取溫度進行單因素試驗。

2.3 正交試驗

據香樟葉葉綠素提取的單因素試驗結果，對料液比、溫度、提取時間進行L9（33）正交試驗，以確定浸提葉綠素的優化條件。

2.4 香樟葉葉綠素穩定性的研究[10-12]

取一定量的香樟葉葉綠素提取液，稀釋10 倍，分別在不同條件下處理后，測定波長665 nm 處的吸光度值，分析不同因素對香樟葉葉綠素穩定性的影響。

3 結果與分析

3.1 單因素對香樟葉葉綠素提取效果的影響

3.1.1 浸提溶劑的選擇

稱取香樟葉5 g，以甲醇、95%乙醇、丙酮、乙醚、氯仿、乙醇：丙酮=1 ∶1、石油醚等7 種溶劑為提取劑，料液比1 ∶50（g/mL）于常溫條件下分別浸提1 d，量取1 mL 提取液于10 mL 的容量瓶中，定容后，于波長665 nm 處測吸光度值，結果見圖1。

圖1 溶劑對香樟葉葉綠素提取效果的影響Fig.1 Effects of different solvents on extraction of chlorophyll from Cinnamomum camphora leaves

由圖1 可以看出，除了氯仿、石油醚外，其余提取劑對香樟葉葉綠素的提取率都較高，最高的是混合溶劑。故試驗采用無水乙醇：丙酮=1 ∶1 混合溶劑作為提取劑。

3.1.2 提取劑濃度的選擇

稱取香樟葉5 g，分別用無水乙醇：丙酮=4 ∶1、2 ∶1、1 ∶1、1 ∶2、1 ∶4 及丙酮和無水乙醇為提取劑，料液比1 ∶50（g/mL），于常溫條件下分別浸提1 d。，量1 mL 取液于10 mL 的容量瓶中，定容后，于波長665 nm 處測吸光度值，結果見圖2。

圖2 混合溶劑配比對香樟葉葉綠素提取效果的影響Fig.2 Effects of different ratio of mixed solvents on extraction of chlorophyll from Cinnamomum camphora leaves

可以看出，無水乙醇∶丙酮=1 ∶1 時，提取效果較好。

3.1.3 料液比的選擇

稱取香樟葉5 g，以無水乙醇∶丙酮=1∶1 為提取劑，料液比分別為1∶5、1∶6、1∶7、1∶8、1∶9、1∶10（g：mL）于常溫條件下分別浸提1 d，量取0.5 mL 提取液于10 mL的容量瓶中，定容后，于波長665 nm 處測吸光度值，結果見圖3。

圖3 料液比對香樟葉葉綠素提取效果的影響Fig.3 Effects of the ratio of material to liquid on extraction of chlorophyll from Cinnamomum camplora leaves

由圖3 可以看出，料液比為1 ∶6（g/mL）時，提取效果優于其他情況。

3.1.4 提取溫度的選擇

稱取香樟葉5 g，以無水乙醇：丙酮=1 ∶1 為提取劑，料液比分別為1 ∶6（g/mL），分別在30、40、50、60、70、80、90 ℃加熱回流提取2 h，提取液定容后，于波長665 nm 處測吸光度值，結果見圖4。

圖4 提取溫度對香樟葉葉綠素提取效果的影響Fig.4 Effects of temperature on extraction of chlorophyll from Cinnamomum camphora leaves

由圖4 可以看出，30 ℃～70 ℃時提取液吸光度值明顯增大，但當溫度超過70 ℃以后，提取液吸光度值開始下降，可能和葉綠素本身的熱穩定性有關。選定70 ℃作為進一步研究的溫度條件。

3.1.5 提取時間的選擇

稱取香樟葉5 g，以選定的溶劑、料液比，在70 ℃分別浸提1.0 h、2.0 h、3.0 h、4.0 h、5.0 h，提取液定容后，于波長665 nm 處測吸光度值，結果見圖5。

由圖5 可以看出，提取時間為2.0 h 時，提取效果最好。

3.2 正交試驗

經過單因素試驗，確定正交試驗因素水平，見表1，試驗結果見表2。

由表2 可知，3 個因素影響次序是B＞C＞A，優化提取工藝是A3B2C2，料液比1 ∶6（g/mL）、溫度60 ℃、提取時間4.0 h。按A3B3C2進行3 次平行試驗，測得平均吸光度值為1.609。

圖5 提取時間對香樟葉葉綠素提取效果的影響Fig.5 Effects of time on extraction of chlorophyll from Cinnamomum camphora leaves

表1 因素水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal test

表2 優化提取條件L9（33）正交試驗設計及結果Table 2 Design and results of orthogonal test of optimization of extraction conditions

3.3 香樟葉葉綠素的穩定性研究

3.3.1 光照對香樟葉葉綠素穩定性的影響

取經10 倍稀釋的葉綠素提取液，于太陽光下分別照射1、2、3、4、5、6 h 后測定其吸光度值。結果見圖6。

圖6 表明，隨著葉綠素在自然光條件下暴露時間的增長，葉綠素提取液的吸光度值在持續下降，當光照4h 時，葉綠素吸光度值下降為0.201，而后4 h 吸光度值變化很小，至6 h 時，吸光度值為0.184。

3.3.2 溫度對香樟葉葉綠素穩定性的影響

取葉綠素提取液置于75 ℃～95 ℃的水浴鍋中溫育1 h，冷卻后測定其吸光度值，結果見表3。

圖6 光照對香樟葉葉綠素的影響Fig.6 Effects of light on stability of chlorophyll from Cinnamomum camphora leaves

表3 溫度對荷葉葉綠素穩定性的影響Table 3 Effects of temperature on stability of chlorophyll from Cinnamomum camphora leaves

表明，葉綠素在85 ℃前吸光度值明顯減小，但85 ℃溫育后其吸光度值降低幅度不大，即香樟葉葉綠素具有一定耐高溫性。

3.3.3 pH 對香樟葉葉綠素穩定性的影響

取葉綠素提取液，調節提取液的pH 分別為1、3、5、7、9、11、13，測定其吸光度值，結果見圖7。

圖7 pH 值對香樟葉葉綠素穩定性的影響Fig.7 Effects of pH value on stability of chlorophyll

表明，隨著pH 的增加，香樟葉葉綠素的吸光度值也在增加，當pH≥7 時，其吸光度明顯下降，即pH 對香樟葉葉綠素的穩定性影響較大。

3.3.4 香樟葉葉綠素的耐氧化性和耐還原性

取定容后的葉綠素提取液10 mL，分別加入5%的抗壞血酸溶液、5%的過氧化氫溶液1mL，結果見表4。

表4 氧化還原劑對葉綠素的影響Table 4 Effects of oxidizer and reducer on stability of chlorophyll from Cinnamomum camphora leaves

加入5%抗壞血酸使綠色略微變淺，其吸光度值略微下降。但加入5%過氧化氫使綠色明顯變暗，其吸光度值明顯下降。因此，香樟葉葉綠素耐還原性較好，但氧化劑對其穩定性有一定影響。

3.3.5 金屬離子對葉綠素穩定性的影響

取葉綠素提取液，分別加入濃度為1 mg/mL 的Al3+、Zn2+、Na+、Fe3+、Ca2+、Cu2+和Mg2+，觀察葉綠素溶液顏色變化，1h 后測定其吸光度值，結果見表5。

表5 金屬離子對荷葉葉綠素穩定性的影響Table 5 Effects of metal ion on stability of chlorophyll from Cinnamomum camphora leaves

Ca2+、K+、Na+、Cu2+、Pb2+、Zn2+對該葉綠素無明顯影響，Fe3+對葉綠素的影響較大，使溶液變為黑色。

4 結論

通過對香樟葉葉綠素提取條件的研究，得出香樟葉葉綠素提取的優化工藝是以乙醇：丙酮=1 ∶1 為提取劑，料液比1 ∶6（g/mL），提取溫度60 ℃，提取時間4.0 h。優化工藝下香樟葉葉綠素吸光度值為1.609。對香樟葉葉綠素的穩定性研究表明，光照影響香樟葉葉綠素的穩定性，當光照時間達4h 時，葉綠素吸光度值急劇下降；葉綠素在85 ℃前吸光度值明顯減小，但85 ℃后其吸光度值降低幅度不大，即香樟葉葉綠素具有一定耐高溫性；pH 對香樟葉葉綠素的穩定性影響較大，隨著pH 的增加，香樟葉葉綠素的吸光度值也在增加，當pH≥7 時，其吸光度明顯下降；香樟葉葉綠素耐還原性較好，但氧化劑對其穩定性有一定影響；Ca2+、K+、Na+、Cu2+、Pb2+、Zn2+對該葉綠素無明顯影響，Fe3+對葉綠素的影響較大。因此在香樟葉葉綠素的提取、加工處理、儲存和使用過程中，應盡可能在避光、低溫、中性條件下進行，防止H2O2、抗壞血酸、Fe3+等的不良影響。可考慮制備相應的鹽類以提高其穩定性。

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