子宮肌瘤患者外周血單核細胞中DcR3基因表達的意義

苑桂娟

子宮肌瘤患者外周血單核細胞中DcR3基因表達的意義

苑桂娟

目的探討外周血單核細胞(PBMC)中DcR3基因表達水平與子宮肌瘤的關系。方法65名子宮肌瘤患者和62名健康對照者各取5ml靜脈血，肝素抗凝，密度梯度離心法分離PBMC，TRIZOL法提取PBMC總RNA，用半定量RT-PCR法檢測PBMC中DcR3基因的相對表達水平，并用t檢驗進行比較。結果子宮肌瘤患者組PBMC中DcR3基因的相對表達水平為(0.845±0.029)，與正常對照組(0.140±0.003)相比有明顯差異(P＜0.01)。結論子宮肌瘤患者PBMC中DcR3基因的表達水平增高。

DcR3；基因表達；子宮肌瘤；外周血單核細胞

子宮肌瘤的發病機制尚未完全闡明，但近年來發現肌瘤與凋亡等信號轉導途徑的紊亂有關，在子宮肌瘤患者的病理組織上發現多種抗凋亡基因的過度表達[1]。新近發現一個可溶性受體蛋白—誘惑受體3(decoy receptor3)能競爭性地與FasL結合，從而阻斷FasL誘導的凋亡，在多種腫瘤、增生性疾病中發揮著重要的作用[2]。凋亡途徑的中斷導致細胞不能正常凋亡，而不斷增生，最終發生子宮肌瘤。本實驗采用RT-PCR法檢測DcR3基因在子宮肌瘤患者及健康人外周血單核細胞(PBMC)中的表達，以探討其表達與子宮肌瘤的關系。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器

Oligod(T)、AMV逆轉錄酶、RNA酶抑制劑、TaqDNA聚合酶、細胞分離液等購自Promega公司。引物由上海生工生物工程公司合成并純化。凝膠電泳成像分析系統TannonGIS1000(Tannon有限公司，上海)，PCR儀FeroTec(杭州PCR儀有限公司)。

1.2 研究對象

子宮肌瘤患者65例，年齡35～65歲。全部病人均經婦科彩超檢查術后病理確診，且未經治療。健康對照組62例，年齡30～64歲。

1.3 實驗方法

1.3.1 PBMC分離

研究對象各取靜脈血5ml，肝素抗凝，加入含5ml淋巴細胞分離液的離心管中，離心2000r/min，20min，可見血漿與分離液的界面上有一白膜層，此即所需的PBMC。吸出細胞至另一試管用生理鹽水洗3遍，離心2000r/min，5min，棄上清。

1.3.2 RNA的提取及RT-PCR

在上述PBMC標本中加入變性裂解液Trizol1ml吹打使細胞充分溶解,置室溫5min后加入氯仿200μ l，劇烈震蕩15s，室溫5min，4℃12000r/min離心15min，取上清加入等體積的異丙醇，混勻后-20℃1h，4℃12000r/min離心10 min，棄上清，加入75%乙醇1ml，4℃7500r/min離心5min,吸去乙醇自然干燥10～20min,溶于10μlDEPC水中。此即人外周血總RNA。在上步得到的10μl模板RNA中，加入1μlDEPC水，1μl引物Oligod(T)，稍離心，100℃沸水1min；加入2μldNTP，4μl5×buffer，2μlAMV逆轉錄酶，稍離心，42℃水浴90min；沸水3min，滅活AMV，得到總cDNA。

聚合酶鏈反應PCR擴增DcR3基因(214bp)和β -actin基因(570bp)。引物序列：DcR3基因引物正義鏈為5′-TCAATGGCCAGGCTCTTC-3′,反義鏈為5′-GCCTCTTGATGGAGATGTCC-3′；β-actin基因引物正義鏈為5′-TGACGGGGTCACCCACACT GTGCCCATCTA-3′。反義鏈為5′-CTAGAAGC ATTTGCGGTGGACGATTGGAGGG-3′。

1.3.3 PCR產物的相對定量分析

5μlPCR產物經1.5%的普通瓊脂糖凝膠電泳后,溴化乙啶染色,通過TannonGIS影像分析儀進行DNA條帶和強度分析，把DcR3/β2actin的比值作為DcR3基因的相對表達水平進行比較。

1.4 統計學處理

2 結果

結果顯示，健康對照組和子宮肌瘤患者PBMC中均檢測到DcR3基因的表達，PCR產物電泳后在214bp大小位置均見有一清亮條帶，與預計的DcR3基因片段大小一致，同時在570bp大小位置也顯示有清亮條帶，此為內參照基因β-actin片段產物。DNA條帶和強度分析示，正常人PBMC中DcR3基因有低水平的表達，其相對表達水平為（0.140± 0.003）；但子宮肌瘤患者PBMC中DcR3基因呈過度表達，其相對表達水平（0.845±0.029）。兩者相比有明顯差異(P=0.012)。

3 討論

本實驗對65例經婦科彩超和病理診斷的子宮肌瘤患者和62例健康人進行了PBMC中DcR3基因檢測，發現子宮肌瘤患者血中DcR3基因表達明顯高于正常人群，說明DcR3基因異常表達與子宮肌瘤有一定的關系。

子宮肌瘤的發病機制尚未完全闡明，但近年來發現肌瘤與凋亡等信號轉導途徑的紊亂有關，在子宮肌瘤患者的病理組織上發現多種抗凋亡基因的過度表達[1]。細胞凋亡是細胞接受某種信號刺激后一種主動性細胞程序性死亡。細胞凋亡的阻斷與腫瘤發生發展密切相關。近年來研究發現bcl-2、bax、p53等基因與生長因子和激素共同作用影響子宮肌細胞的生長、分化、增生和凋亡。而誘惑受體3能阻斷細胞凋亡途徑，在多種腫瘤、增生性疾病中發揮著重要的作用[2]，故可能在子宮肌瘤的發生與發展中起一定的作用。

DcR3是一個含300個氨基酸的蛋白質，分子量為35KD。1998 年Pitti等[2]搜查EST數據庫時發現一組與TNFR基因超家族成員有同源性的ESTs，通過重疊序列，從人胚肺中分離出一條新的全長cDNA，并把此cDNA編碼的蛋白稱DcR3；進一步研究發現DcR3基因在肺癌、結腸癌細胞中高度表達，在外周血單核細胞(PBMC)中也可檢測到DcR3基因的表達；Wu等[3]為了探討血清DcR3對腫瘤的診斷意義，運用ELISA方法檢測了數十例腫瘤、急性感染、肝硬化患者及健康對照者血清DcR3水平，結果顯示，56.2%腫瘤患者血清DcR3呈陽性。DcR3可通過抗細胞凋亡、降低宿主免疫系統功能以及促使腫瘤血管形成等促進腫瘤的發生發展，運用單克隆抗體與RNA干涉(RNAi)技術有可能從蛋白水平和基因水平阻斷DcR3的表達，解除DcR3對腫瘤細胞的凋亡抑制作用、恢復機體正常免疫功能[4]。

有資料表明[5]，DcR3基因在矽肺、肺纖維化、關節炎等患者PBMC中高度表達，提示DcR3過度表達可能在這些疾病的發病過程中發揮重要的影響。本研究表明，子宮肌瘤患者PBMC中DcR3基因的過度表達，與正常人相比有統計學意義，提示高度表達的DcR3可能阻斷細胞凋亡，可能與子宮肌瘤的發病有關。李衛平等應用RT-PCR法測定21例肌瘤患者,發現肌瘤組織內bcl-2/bax比值顯著高于正常子宮平滑肌[6]。郭昕等用免疫組化ABC法在50例患者中發現了同樣的結果[7]。bcl-2基因過度表達抑制了肌瘤細胞的凋亡，使細胞生存時間延長，導致細胞堆積或細胞突變率增加。這些抗凋亡基因的過度表達可能與DcR3阻斷凋亡途徑有關，所以說DcR3對子宮肌瘤患者的發病機制有一定的貢獻。因此可稱為子宮肌瘤診斷的標志物或者為治療子宮肌瘤提供新的靶位。

[1]李小花,歸綏琪.子宮肌瘤的分子遺傳學研究進展[J].生殖與避孕,2006,26（12）:740-744.

[2]Pitti RM，Marsters SA，Lawrence DA，etal.Genomic amplification of a decoy receptor for Fas ligand in lung and colon cancer [J].Nature，1998，396 (6712)：699-703.

[3]Wu Y,Han B,Sheng H,etal.Clinical significance of detecting elevated serum DcR3/TR6/M68 in malignant tumor patients[J].Int J Cancer, 2003,105(5):724-732.

[4]Li H,Zhang L,Lou H,etal.Overexpression of decoy receptor 3 in precancerous lesions and adenocarcinoma of the esophagus[J].Am J Clin Pathol,2005,124(2):282-287.

[5]王秀麗,尹金植,黃志衛,等.特發性肺間質纖維化病人外周血單核細胞中DcR3基因表達的意義[J].中國老年學雜志,2004,24(12):1129-31.

[6]李衛平,嚴雋鴻,林其德,等.凋亡調控基因Bcl-2/Bax mRNA在子宮平滑肌瘤中的表達[J].上海第二醫科大學學報,2000,20(6):514-7.

[7]郭昕,佟麗波,杜佳秋.細胞凋亡相關基因bcl-2和bax在子宮肌瘤中表達的意義[J].黑龍江醫藥科學,2004,27(4):55-6.

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