改良抗酸染色法的經(jīng)驗交流

龐霞 尹玉慧 宋一民 趙華瑩 陳月 高冬玲

抗酸桿菌（acid fast bacili）體內(nèi)含有脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和多糖類，由糖脂形成一個蠟質(zhì)的外殼，它有特殊功用，如對一般染料不宜著色，但能與苯酚堿性復紅結合成復合物，這種復合物能抵抗酸溶液的脫色作用，所以成為抗酸桿菌[1]。實驗室常用Ziehl-Neelsen方法，但存在一些弊端，故作者嘗試對該方法進行改良，效果顯著，現(xiàn)介紹如下。

1 材料與方法

1.1 材料

來自鄭州大學第一附屬醫(yī)院每天送驗的新鮮手術標本。

1.2 溶液配制

①10%高碘酸水溶液：高碘酸10g，蒸餾水加至100ml。配制后置4～8℃冰箱保存，可用半年；②堿性復紅酒精溶液：堿性復紅 1g，用無水酒精 10ml配制。③5%苯酚水溶液：苯酚 5ml、蒸餾水加至100ml。④苯酚堿性復紅溶液：堿性復紅酒精溶液10ml和5%苯酚水溶液90ml混合，用前過濾。⑤20%硫酸水溶液

1.3 方法

①組織常規(guī)脫水包埋，切片厚度4～6μm待用。②將切片用等量的汽油和松節(jié)油混合液脫蠟三次，每次10min。③不用梯度酒精處理，只用吸水紙吸干油液。④水洗 5min。⑤10%高碘酸水溶液室溫氧化20 min后充分水洗。⑥滴加苯酚堿性復紅溶液在75℃的烤片機上染20min后水洗。⑦用20%硫酸水溶液分化至適當為止，充分水洗。⑧吸干水分，入烤箱烘干、封固。

2 結果

抗酸桿菌經(jīng)染色后呈鮮紅色，背景干凈，有利于提高診斷率，并且可以長期保存。

3 討論

目前結核病的發(fā)病率呈逐漸上升趨勢水平，抗酸染色是檢測結核病重要病理診斷之一，由于染色試劑和染色技術是影響抗酸染色質(zhì)量的重要因素，根據(jù)多年的經(jīng)驗淺談如下：①適當增加切片的厚度，4～6μm 最為適宜，可以提高檢出率。②用二甲苯脫蠟可溶解抗酸菌脂質(zhì)外殼，致抗酸性隨之減弱或消失，不易染色，可見脫蠟是關鍵性工作[2]。等量的汽油和松節(jié)油混合液脫蠟即保存菌體脂質(zhì)，使菌體壁等不受破壞，也保存菌體壁的完整性。另外脫蠟后禁止灑精洗，以防酒精對菌體內(nèi)脂質(zhì)的破壞，降低染色效果。應注意的是：脫蠟劑配制汽油和松節(jié)油要相等，脫蠟劑使用時間不能過長，要隨時更換。③研究發(fā)現(xiàn)：經(jīng)高碘酸氧化后，染出的片子不但顏色鮮艷，而且可以長期保存。高碘酸能使抗酸桿菌菌壁上的糖脂兩個相鄰的帶有羥基鍵打開而氧化成醛基，而堿性品紅能與醛基發(fā)生反應[3]，產(chǎn)生抗酸性的紫紅色基團，從而使苯酚堿性復紅與抗酸桿菌結合更加牢固。④我們根據(jù)抗酸桿菌的細胞結構和特點對染色試劑加以改良配制。用苯酚堿性品紅液，它易與抗酸菌酸牢固結合生成復紅一抗酸菌酸復合物，一旦染上顏色[4]，由于脂質(zhì)的存在，即使強脫色劑也不容易使之脫色。并且我們用無水酒精來最大限度地溶解堿性品紅，而以苯酚作為媒染劑，以提高染料染色性能，使堿性品紅與抗酸桿菌牢固結合，提高了染色效果。但苯酚堿性品紅液極易出現(xiàn)沉淀，滴染時要過濾后再染。⑤結核桿菌的菌體含有脂質(zhì)外殼，具有抗一般染料難以滲入菌體，故結核桿菌著色困難，所以染色過程中需加熱。傳統(tǒng)的加熱方法是用酒精燈火焰加熱，但酒精燈火焰溫度過高，加熱不均不易控制，并且容易脫片。作者實踐中發(fā)現(xiàn)在 75℃的烤片機上染色，可以避免以上的弊端，但注意的是：加熱過程中，在烤片機上放一張吸水紙，防止平移載玻片染液外溢，污染烤片機；并且隨時補加染液，防止干燥產(chǎn)生假陽性。⑥研究還發(fā)現(xiàn)，不復染可避免美蘭染色背景掩蓋菌體顏色出現(xiàn)假陰性，使抗酸桿菌的紅色顆粒更易于識別。⑦20%硫酸水溶液褪色較弱，時間稍長影響不大。

[1]許文兵.表面活性劑在 Wade-Fite法中的應用[J].臨床與實驗病理學雜志,2005,21(6):645

[2]梁建中,武延雋,車德才.改良傳統(tǒng)組織切片抗酸染色法[J].廣東醫(yī)學,2005,6(11):1545.

[3]張萬鵬,韓建德,金東勛,等.高碘酸在抗酸染色中的應用[J].中國麻風皮膚病雜志,2006,22(7):537.

[4]沈武成,蔡曉雯.改良抗酸染色法的體會[J].醫(yī)藥論壇雜志,2008,29(24):97-98.