大蒜多倍體誘導及其研究進展

溫艷斌 程智慧

（西北農林科技大學園藝學院，農業部西北地區園藝作物生物學與種質創制重點實驗室，陜西楊凌 712100）

多倍體即體細胞中含有3套或3套以上基因組的生物，是植物物種形成和進化的重要途徑之一。染色體數的增加及由其引起的基因冗余被認為是真核生物（尤其是有花植物）進化的主要原動力（Stebbins，1971）。70%的被子植物經歷過一個或多個多倍化的階段，蕨類植物中多倍體的頻率更是高達90%（Masterson，1994）。現代農業中的重要作物如苜蓿、馬鈴薯等是同源多倍體，小麥、燕麥、棉花、咖啡豆為異源多倍體（程治軍 等，2005）。而通常被認為是二倍體的玉米、大豆、白菜類作物甚至擬南芥也在進化的早期經歷了多倍化的過程（Osborn et al.，2003）。

作為物種進化過程的一個關鍵步驟，多倍化導致基因單個拷貝選擇壓的減輕，從而為基因的進化和物種的形成提供了遺傳物質的基礎和潛力。多倍體植株的器官和細胞表現出“巨型性”的顯著特征，對于提高作物產量和有效成分含量具有重要意義。同時，多倍體植物在新開放或相對不穩定的環境中具有更強的生存能力，具有更大的生理和生化的靈活性，比二倍體祖先或近緣種有更強的對惡劣環境的耐受能力，在營養繁殖和多年生植物中具有明顯的優勢（焦鋒和樓程富，2001）。

大蒜（Allium sativumL.）是百合科蔥屬二年生草本植物，中國大蒜栽培面積和產量均居世界首位，大蒜品種資源較為豐富。但由于長期進行無性繁殖，大蒜的遺傳學和生物學多樣性不能夠得到充分利用，同時一些優良種質也因種性退化而瀕臨滅絕，因此種質資源創新和新品種培育勢在必行（徐培文 等，2006）。自 Blakeslee和 Avery（1937）開創倍性育種先河以來，全球掀起了多倍體育種熱潮。作為潛在的多倍體育種優勢材料，大蒜多倍體育種研究也受到關注，但總體進展緩慢。

1 獲得多倍體植物的途徑

多倍體植物可通過自然途徑或人工途徑獲得。自然途徑包括體細胞染色體自發加倍、多精受精以及未減數配子融合產生多倍體（孫靜賢 等，2005），但該途徑效率很低。植物多倍體主要通過以下人工途徑獲得。

1.1 物理方法

機械創傷，如摘心、嫁接等是最早的物理誘導植物多倍體的方法，后來人們用溫度激變（李云 等，2000）、輻射（畢春俠 等，1999；唐寧，2007）等強烈因素誘導染色體加倍。這些方法均有成功的報道，但多倍體的誘導率低，嵌合率高，因此未被廣泛利用。在大蒜多倍體誘導方面也未見報道。

1.2 無性系變異法

植物體細胞無性系變異，又稱植物體細胞克隆變異，泛指在植物細胞、組織和器官培養過程中，培養細胞和再生植株中產生的遺傳變異或表觀遺傳學變異（Larkin & Scowcroft，1981）。染色體數變異是其中一個方面，主要是由有絲分裂過程中紡錘體行為異常造成。不同程度的紡錘體缺失導致染色體不分離、移向多極、滯后或不聚集，最終產生倍性變異細胞。同時，無絲分裂也是染色體倍性變異的一個重要原因（D’Amato & Bayliss，1985）。

利用無性變異法獲得大蒜四倍體雖已有很多成功的報道，但誘導率尚不高，且倍性變異目標性不強。Novak（1980）以大蒜葉片和頂端分生組織為外植體通過愈傷組織途徑獲得的株系，只有2.2%為四倍體。Al-Zahim等（1999）對3個大蒜品種的愈傷組織培養14個月，后經體細胞胚胎途徑得到75個株系，發現7株為四倍體，占9.3%。欒非時等（1993）、徐培文和馬偉青（1998）、張恩讓等（2004）也發現大蒜經愈傷組織途徑可以產生四倍體再生植株，認為染色體數變異與基因型有關，倍性變化主要是由培養過程中外源生長素（特別是 2，4-D）濃度偏高造成的。在對柑橘、豇豆、豌豆以及甘草等愈傷組織誘導培養中，也發現2，4-D等生長素對愈傷組織染色體有加倍作用（鄧秀新和劉功弼，1985；Mathur & Prakash，2000；Sanal Kumar & Mathur，2004；張俊娥，2009；黃惠英 等，2011）。

1.3 原生質體融合法

原生質體融合培養過程中也可能產生多倍體（彭靜 等，2010）。Mattheij和Puite（1992）采用對稱融合法成功融合了2種二倍體馬鈴薯的原生質體，并獲得6個四倍體株系，田間性狀鑒定發現了 1個高產株系，開辟了馬鈴薯商業化倍性育種的新途徑。不久，通過電融合、化學融合技術相繼得到了更具活力的高產抗逆多倍體馬鈴薯（Waara et al.，1992；Cardi et al.，1993）。Yamashita等（2002）將大蒜與洋蔥體細胞進行電融合，最終得到了分別含有40條和41條染色體的2個雜交株系。通過基因組原位雜交發現，兩個株系中均含有17條大蒜染色體。該研究雖未得到整倍性變異株系，但在大蒜多倍體育種研究中也值得借鑒。

1.4 化學方法

目前，化學方法是人工誘導大蒜多倍體的主要方法。

1.4.1 多倍體化學誘導劑及誘導原理 根據植物細胞分裂周期可知，凡是能夠影響處于 S期（DNA合成期）末到有絲分裂末期結束前這一時期的化學試劑均可作為潛在的有絲分裂抑制劑，即多倍體誘導劑（Dhooghe et al.，2011）。目前已報道的多倍體誘導劑多屬于有絲分裂中期抑制劑，其中秋水仙素是誘導植物細胞染色體加倍最普遍的藥劑，它通過介導細胞有絲分裂中期，阻止構成紡錘體微管的α、β二聚體的組裝，導致微管一端α、β二聚體的分解速度高于另一端的組裝速度，使得微管解聚（Vaughn，2000；Dewitte & Murray，2003），進而阻止細胞分裂后期的染色體向兩級移動，最終導致細胞不能分裂，形成染色體數目加倍的細胞。

秋水仙素作為多倍體誘導劑已有 70多年的歷史，人們逐漸發現其對許多植物具有毒害作用，如導致不育、畸形生長、染色體丟失、染色體重排以及基因突變（Luckett，1989）。由于它對植物微管蛋白的親和性遠遠低于對動物微管蛋白的親和性（Morejohn et al.，1987），誘變植物時常用較高的濃度，因此對操作者的毒害作用更強，也更易造成植物死亡，誘變率低，并且較高的價格也成為一大負擔。因此，人們一直在努力尋求新的化學誘變劑以替代秋水仙素。

隨著農業上除草劑的大量使用，人們發現一些除草劑具有抑制有絲分裂的效應，可作為秋水仙素的替代品。并且這些除草劑與植物細胞微管蛋白的親和性更高（Bajer & MoleBajer，1986；Morejohn et al.，1987；Hugdahl & Morejohn，1993），對人體毒害作用小。目前用于染色體加倍的除草劑主要有二硝基苯胺類（安磺靈、氟樂靈），磷酰胺類（甲基胺草磷）（Hansen & Andersen，1996；Khosravi et al.，2008；Quesenberry et al.，2010）以及甲基酰胺類（戊炔草胺），氨基甲酸酯類（氯苯胺靈）等（Dhooghe et al.，2011）。特別是二硝基苯胺類除草劑，已成為標準的秋水仙素替代劑。

1.4.2 活體誘導法 通常是通過涂抹、浸泡、包埋或注射等方式處理處于有絲分裂旺盛期的幼苗生長點進行誘變。周香君和程智慧（2008）進行了大蒜活體誘導嘗試，采用秋水仙素溶液注射大蒜蒜瓣生長點，發現濃度為0.1%的秋水仙素溶液對染色體的誘導效果最佳。處理后大蒜葉片下表皮氣孔長度、寬度、面積和周長極顯著增大，且氣孔密度減小，部分根尖染色體數目加倍。此后，也有嘗試包埋法誘導大蒜多倍體的研究（謝曉玲和鄧自發，2009；王曉桐和張金鳳，2010），但也只得到了含有部分四倍體細胞的根尖，均未獲得多倍體大蒜植株。

活體誘導多倍體方法簡便易推廣，但是其耗藥量大，所獲得變異株通常是嵌合體，誘導率低，特別是對于生長點隱匿于貯藏葉中的大蒜，對其多倍體誘導技術有待進一步的探索。

1.4.3 組織培養誘導法 與活體誘導法相比，組織培養誘導法具有很多優點。首先是便于取得大量均一的誘導材料，用組織培養法可獲得大量分裂旺盛的叢生芽、莖段和愈傷組織等誘導材料；并且組織培養條件容易控制，試驗結果重復性好。其次，可減少并有利于及時分離嵌合體。對材料組織培養后再作誘導處理，能使誘導加倍的多倍體單細胞分化出不定芽，并發育成單株，形成同質多倍體，提高誘導率，有效排除嵌合體的干擾，并且縮短多倍體培育時間。

組織培養誘導大蒜多倍體一般有浸泡和固體培養基混培 2種方法，適用于多種類型的誘導材料。Novak（1983）將大蒜莖尖預培養7 d再浸泡或直接接種于含0.3%秋水仙素+4%二甲基亞砜（DMSO）的液/固體培養基中，四倍體誘導率最高分別為35.7%和25.3%。張雨等（2012）將大蒜莖尖接種于含10 μmol·L-1甲基胺草磷+1.5% DMSO的固體培養基中6 d，四倍體誘導率達32.9%。余建明等（1991）用0.1%秋水仙素+1.5% DMSO浸泡大蒜愈傷組織6 d，愈傷組織四倍體細胞達31%以上。周香君等（2009）也以愈傷組織為誘導材料，接種于含有0.1%秋水仙素或100 μmol·L-1二甲戊靈的固體培養基中，最終得到了4%和6%的四倍體植株。張素芝和李紀蓉（2006）將氣生鱗莖生長良好的健壯花苞置于含0.2%秋水仙素+1.5% DMSO的液體培養基中，四倍體誘導率達38.4%，而接種于含0.025%或0.05%秋水仙素+1.5% DMSO的固體培養基時，四倍體誘導率高達66.7%。

2 影響大蒜多倍體誘導的因素

2.1 誘導材料類型

不同類型的誘導材料對藥劑的耐受性不同，在很大程度上決定了多倍化的誘導效率。直接處理大蒜蒜瓣，誘導效果不佳，至今未獲得四倍體大蒜植株。目前已成功誘導多倍體大蒜的材料均為處于旺盛有絲分裂期的愈傷組織、莖尖和氣生鱗莖。許多研究表明，基因型影響植物多倍化誘導率（Petersen et al.，2003）。

2.2 誘導劑濃度和處理時間

誘導劑濃度與處理時間有明顯的互作效應，針對每一材料多倍化誘導，均需設置濃度梯度和不同時間以篩選最佳濃度和時間組合（Dhooghe et al.，2011）。一般高濃度短時間（張素芝和李紀蓉，2006）和低濃度長時間組合（余建明 等，1991；于文艷，2008；張雨 等，2012）可保證大蒜多倍體較高的存活率和誘導率。

2.3 誘導劑溶劑及處理溫度

不同溶劑對植物的傷害程度不同，在植物體中的運轉效率不同，因而會影響多倍體誘導效果。DMSO是最常用的誘導劑溶劑，它可以提高植物細胞的滲透性，使誘導劑快速進入植物組織，提高其染色體加倍效果（Hamill et al.，1992）。Novak（1983）認為DMSO能減輕秋水仙素的藥害，并降低嵌合體發生率。處理溫度對染色體加倍也有一定影響。張素芝和李紀蓉（2006）研究表明，25、30 ℃時短時間處理的誘導率明顯高于4 ℃低溫處理，但處理時間較長時4 ℃低溫也有較高的誘導率。

3 多倍體大蒜的鑒定方法

3.1 形態組織學鑒定

形態學鑒定法是最簡易、最直觀的方法。多倍體植物的外部形態特征與二倍體有明顯差別，因此觀察生長發育期間植株的外部特征可初步判定其倍性水平。與二倍體試管苗相比，多倍體大蒜試管苗較粗壯，生長相對緩慢；其下表皮氣孔長度、寬度均顯著高于二倍體，且氣孔密度降低（張素芝和李紀蓉，2006；周香君，2008）。在田間條件下，四倍體大蒜植株的假莖粗與長，葉片長度與寬度在整個生長期始終大于二倍體植株。生長172 d時，四倍體假莖粗、假莖長和葉片長、葉片寬分別比二倍體增加97.6%、20.0%、28.1%和73.7%（于文艷 等，2008）。

3.2 染色體計數法

染色體計數法是最直接、最準確可靠的方法。目前一般以愈傷組織（余建明 等，1991；徐培文和馬偉青，1998）、根尖（Al-Zahim et al.，1999；張素芝和李紀蓉，2006；王曉桐和張金鳳，2010）為鑒定材料，采用壓片法制備染色體樣，鏡檢觀察染色體數。但染色體計數法技術要求較高，工序繁瑣耗時，不適于大規模鑒定。

3.3 流式細胞術鑒定

由于對多倍體進行早期鑒定可節省大量時間和精力（V?in?l?，2000），近年來流式細胞術在多倍體早期鑒定中的應用愈來愈廣泛（李林光 等，2007；Obidiegwu et al.，2010）。流式細胞術是一種快速、高通量的檢測方法，適合任何類型的組織、細胞，克服了染色體計數法的根尖專一性限制（Leus et al.，2009），取材更方便。其原理是用特異熒光染料對細胞核DNA染色，然后測定熒光密度，由于熒光密度與DNA含量成正比，因此可以間接判斷細胞染色體的倍性。如在離體培養過程中，試管中的芽或植株很小或很幼嫩時，僅用微量樣品就能鑒定出材料倍性，其制樣簡單，靈敏度、分辨率及準確性較高，數據可重復性好，測試速度快，特別適用于樣品較多的倍性檢測分析（陶抵輝 等，2009）。

3.4 分子標記鑒定

染色體倍性變異還可能伴隨著染色體DNA結構變異。隨著分子生物學的發展，分子標記技術在多倍體鑒定中的應用潛力逐漸顯現出來。Sugawara等（1995）曾用RAPD標記技術快速檢測了柑橘突變體嵌合體情況。通過SSR分析發現多倍體沙田柚發生了DNA水平變異，表現為帶紋缺失和新增（向素瓊 等，2008）。SRAP與AFLP分子標記技術表明不同倍性西瓜之間的多態性較低，但其多倍體出現特有的多態性條帶（劉文革 等，2004；李曉慧 等，2007）。ISSR分析發現，刺梨四倍體缺失位點數12個，占7.1%，新增位點數5個，占3%（王小平 等，2010）。利用AFLP分子標記技術也發現，同源四倍體與對應的二倍體桑樹相比，DNA分子遺傳結構發生了一定程度的改變，其DNA多態性高達30.4%（王卓偉 等，2002）。

3.5 同工酶鑒定

一般認為，由于多倍體植株同工酶同一位點基因劑量加倍，控制該位點的酶量增加，同工酶電泳譜帶的深度增加，而二倍體同工酶電泳譜帶則沒有類似的特征。另有一些研究還發現多倍體同工酶譜帶數增加的現象，說明多倍體等位基因數較多，遺傳雜合性增加（孫慶華和韓振海，2008）。因此，同工酶分析可以為多倍體鑒定和選育提供生理生化指導。

對二倍體與四倍體蘿卜的酯酶同工酶酶譜分析發現，四倍體有 1～2條特異條帶且顏色較深，過氧化物酶與超氧化物歧化酶酶譜帶與二倍體相同，但譜帶顯色深（徐偉鈺 等，2006）。程心旻等（2003）分析 8個白術四倍體株系與二倍體的過氧化物酶同工酶酶譜差異，發現四倍體各株系獨有Rf=0.310的譜帶。黃芩同源四倍體與二倍體相比，多倍體株系中葉片抗壞血酸過氧化物酶總活力均高于二倍體，且兩年生黃芩葉片的過氧化物酶同工酶酶譜在Rf=0.494和0.512處出現新的譜帶（謝小群和高山林，2002）。對過氧化物酶同工酶酶譜分析也發現，蘭州百合和桑樹的多倍體與二倍體酶譜帶型有差異（蘇超 等，2003；劉靜，2011）。

4 大蒜多倍體研究中存在的問題

4.1 大蒜多倍體誘導技術

目前，多倍體育種的大量資料表明，多倍體誘導效率是由植物種類、誘導劑種類、外植體種類以及誘導方法等因素相互作用決定的，沒有通用的“最佳”誘導方法。因此，仍需要進一步探索高效低毒價廉的新型多倍體誘導劑，完善創新大蒜多倍體誘導技術體系。

嵌合體仍然是多倍體育種中的難點，真正同一倍性的多倍體誘導頻率尚不高。目前，組織培養法是克服嵌合體的主要有效途徑。鄭思鄉等（1996）用試管苗誘變蘆筍多倍體，利用不定芽技術篩除嵌合體，得到了完全四倍體。Fujishige等（1996）通過以纖細單冠菊的芽原基為外植體建立的穩定再生體系，高效減少了嵌合體的發生并分離得到大量同質四倍體。隨著大蒜組織培養技術的逐漸成熟，利用多種再生途徑，如不定芽誘導、體細胞胚懸浮系培養等，可望大幅減少或避免嵌合體的發生。

4.2 多倍體大蒜種質評價和創新

在自然界，新物種產生之后還要經過長期的自然選擇才能形成相對穩定的種群，從野生種到栽培種也需要經歷漫長的歲月。可以預見，通過人工誘導具有潛在利用價值的新作物相當困難（黃群策和代西梅，2006）。因此，選擇對多倍體特別是同源多倍體育種具有重要意義。對于誘變的多倍體大蒜株系，從多方面進行評價選擇的同時，還應考慮采用其他有效措施，如輻射技術、無性系變異技術、離子束生物工程技術等，不斷創造新變異，篩選具有生產潛力的大蒜新種質。

4.3 多倍體大蒜性狀變異及機理

多倍化對植物造成了基因組沖擊，植物也會在基因和生理層面進行調整，特別是諸如加倍基因的丟失、基因表達模式及表觀遺傳變化引起的基因組修飾（Osborn et al.，2003；Otto，2007；Parisod et al.，2010），最終導致多倍體植物在形態功能、生理生化乃至抗性等方面的表現變化。目前，對于大蒜多倍化后的各類變異，特別是組織細胞學、細胞遺傳學、基因表達機制、基因甲基化模式等方面的研究仍是空白，有必要開展研究，從多角度闡明大蒜染色體多倍化后的性狀變異及機理。

5 多倍體大蒜的應用潛力

5.1 種質材料創新及新品種選育

通過各種途徑獲得的多倍體是重要的種質材料，甚至可直接培育出新品種。四倍體葡萄巨峰系列品種的培育和利用最具代表性，梨四倍體也有成功利用的報道。蔬菜作物中已有蘆筍、大白菜、小白菜、茄子、金針菜等四倍體品種（系）的育成與應用（李樹賢，2003）。作為以營養器官為產品的無性繁殖植物，大蒜多倍體種質的創新和利用具有極為廣闊的前景。

5.2 提高產量

植物染色體多倍化之后，其外部形態特征和二倍體有明顯的差別，主要表現為器官“巨大性”。一般而言，同源多倍體植株高大，生長勢強，莖粗、葉厚，葉片長度、寬度增長率大，葉面積增加，光合能力增強，這些都成為了多倍體植物高產的基礎。

果葉兼用型四倍體桑樹較二倍體桑樹葉綠素含量和RuBPcase羧化活性提高，葉綠體基粒片層和基質片層豐富，垛疊疏松，排列有序，凈光合速率（Pn）高于無性系親本二倍體，年平均產葉量和產果量提高38%和45.89%（王茜齡 等，2011）。劉惠吉等（1990）選育的普通白菜四倍體品種南農矮腳黃，與二倍體相比，葉色更深，葉片更厚，產量增加20%～30%。種植4 a的同源四倍體與二倍體黃花菜長嘴子花相比，葉片長、寬、厚分別增加28.00、0.61 cm和0.11 mm；花蕾粗壯，平均長度增加1.14 cm，粗度增加0.40 cm，單蕾平均干質量增加0.61 g，百蕾干質量增加17.1 g，超過了國家一級標準（何立珍 等，1994）。四倍體蘇聯蒜與其二倍體相比，葉面積和凈光合速顯著增大，葉綠素a含量顯著增多（于文艷 等，2008），是高產的生理基礎。

5.3 改善品質

植物染色體倍性的增加往往會導致次生代謝產物含量的提高。同源四倍體小型西瓜與其二倍體相比，果實中心可溶性固形物含量增加1.8%～5.7%，番茄紅素含量增加8.7%～88.4%，說明人工誘導可獲得高番茄紅素含量的多倍體小型西瓜（王鎮 等，2010）。同源四倍體黃花菜商品品質佳，干花淡白色、無褐嘴，外觀美，味甜而脆，營養品質佳，每百克干樣中游離氨基酸含量比二倍體增加456 mg，其中賴氨酸含量提高了50%左右（何立珍 等，1994）。同源四倍體茄子品種新茄1號果實VC、脂肪、蛋白質含量均較其二倍體種明顯增加（李樹賢 等，2002）。同源四倍體甜瓜與相應二倍體相比，其可溶性固形物、可溶性糖和VC含量分別提高20%、40%和500%（Zhang et al.，2010a）。同源四倍體藥用植物的活性成分，如曼陀羅中的生物堿，黃芩中的黃芩苷含量也均比二倍體高（Berkov & Philipov，2002；Gao et al.，2002）。近年來，大蒜素的醫療保健作用已被更多人了解，提高大蒜素含量將是今后大蒜品質育種的重要方面。于文艷（2008）研究表明，四倍體蘇聯蒜蒜薹和鱗莖中大蒜素含量分別比二倍體高74.1%和66.7%，可溶性蛋白、可溶性糖、游離脯氨酸和 VC含量也均顯著高于二倍體，可作為培育優質大蒜的潛在種質材料。

5.4 增強抗逆性

植物多倍化后會產生新的具有潛在應用價值的生理性狀，如對各種非生物或生物脅迫的抵抗力增強。劉文革（2003）試驗發現，在NaCl脅迫下，不同倍性的蜜枚西瓜從種子萌發期到幼苗期，生長差異明顯，四倍體西瓜的耐鹽性明顯強于二倍體。四倍體生姜無論是在高溫或是在低溫下，其受害程度均較輕，恢復生長的能力較強，比二倍體具有更強的抗熱性和抗寒性（商宏莉 等，2003），在四倍體盾葉薯蕷和四倍體普通白菜中也分別發現了其耐熱性和抗寒性的增強（張蜀寧等，2008；Zhang et al.，2010b）。干旱脅迫下，四倍體金銀花與二倍體相比，復水后生長恢復迅速，耐旱性強（Li et al.，2009）。此外，染色體加倍后的四倍體黑麥草獲得了更強的抗病性（Dhooghe et al.，2011）。在大蒜生產中，普遍存在低溫、鹽漬化、病害等逆境脅迫，大蒜四倍體葉片和鱗莖中的 SOD、POD、CAT活性均較二倍體大幅增加，表明四倍體植株可能較二倍體具有更強的抗逆性（于文艷 等，2008），利用其潛在的抗逆性有望實現大蒜抗逆種質的創新。

大蒜生產中普遍存在品種混雜、退化、產量低和品質差等問題，迫切需要加快大蒜新品種，特別是優質專用出口型品種的選育。基于多倍體的優勢及大蒜繁殖特性，多倍體育種對于拓寬創新大蒜種質資源，培育高產優質大蒜新品種十分重要。隨著植物多倍體育種技術的完善和創新，以及分子生物學研究的開展，大蒜多倍體育種將呈現出更加巨大的應用潛力。

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