乳中抗生素殘留及其檢測方法的研究進展

陳云，李洪亮，張冬潔，趙樹平，于景華,2

（1.內蒙古蒙牛乳業(yè)（集團）股份有限公司，呼和浩特 011500；2.天津科技大學，天津 300457）

乳中抗生素殘留及其檢測方法的研究進展

陳云1，李洪亮1，張冬潔1，趙樹平1，于景華1,2

（1.內蒙古蒙牛乳業(yè)（集團）股份有限公司，呼和浩特 011500；2.天津科技大學，天津 300457）

介紹了乳中抗生素殘留的原因、抗生素殘留的種類以及國內外應用于乳中抗生素的檢測方法，同時對不同種類抗生素的測定方法進行比較，為乳中抗生素檢測新方法開發(fā)提供理論依據。

抗生素；牛奶；檢測方法；殘留

0 引 言

近年來，牛奶中抗生素殘留問題日益受到人們的注目。據調查，目前我國一般奶牛場中奶牛乳腺炎等疾病的患病率在30%左右[1]。為了預防和治療乳牛的各種疾病，乳牛常被注射和飼喂各種有關的抗生素藥物，不可避免的會造成牛奶中抗生素的殘留；另外，奶牛在攝取的飼料中也可能含有多種抗生素類藥物。在歐美國家多年前即以法規(guī)禁止抗生素殘留超限量的牛奶上市。不含有抗生素殘留已成為國際市場原料奶的收購標準[2]。在我國，食品衛(wèi)生國標中牛奶中抗生素殘留允許量仍是一個空白，2001年9月農業(yè)部發(fā)布了《無公害食品生鮮牛奶》行業(yè)標準，這個標準對生鮮牛乳的衛(wèi)生指標明確了“抗生素不得檢出”[3]。因此，降低原料乳中抗生素的殘留水平和控制其危害是目前我國乳品加工企業(yè)所面臨的難題，開發(fā)高效準確的抗生素檢測方法是降低乳制品中抗生素的關鍵所在。

1 乳中抗生素殘留的原因及其危害

牛乳中抗生素殘留的主要原因是非治療目的的用藥、治療目的的用藥和非法人為摻雜。非治療目的的用藥主要指在牛飼料中添加含有一定比例的抗生素的飼料添加劑，作用是預防疾病，這是牛乳中抗生素殘留的重要原因；另一方面，利用抗生素治療乳牛臨床型、隱性型乳房炎和子宮內膜炎，其中乳管注藥法就是讓藥物直接注入乳房，通過乳腺管進入某個已感染區(qū)進行消炎，乳牛在接受這種治療后，乳中的藥物殘留期可延緩到停藥3～5d后[4]。美國食品和藥品管理局（FDA）調查表明，泌乳期乳牛用藥不當或不注意安全是牛乳中抗生素殘留的主要原因[5]。

牛乳中抗生素殘留可導致牛乳的發(fā)酵不能正常完成或出現異常發(fā)酵，不利于發(fā)酵乳制品的生產；有些藥物本身具有抗原性，直接刺激機體產生抗原抗體反應，造成過敏反應，如青霉素類藥物分子的基團可以直接與蛋白質或多糖發(fā)生共價結合反應，形成完全抗原，產生免疫活性，嚴重者甚至危及生命；動物在反復接觸某種抗菌藥物（尤其是飼料藥物添加劑）情況下，體內耐藥菌株大量繁殖，耐藥菌株可通過動物性食品傳播給人，給醫(yī)學臨床感染性疾病的治療造成困難[6]。正常人體內寄生著大量菌群，如果長期與動物性食品中低劑量的抗菌藥物殘留接觸，就會抑制或殺滅敏感菌，耐藥菌或條件性致病菌大量繁殖，微生物平衡遭到破壞，人與動物易發(fā)感染性疾病，如四環(huán)素類藥物引起的二重感染[7]。

聯(lián)合國糧農組織（FAO）及世界衛(wèi)生組織（WHO）在1969年提出，應對各種動物性食品中的抗生素殘留提出允許標準，并建議在乳牛中接受抗生素治療停藥后至少3 d（最好5～9 d）內的乳汁不能作為食用乳的原料。美國食品和藥品管理局（FDA）規(guī)定每毫升牛乳中的抗生素殘留不得超過0.006國際單位,使用抗生素的牛乳在96h內應廢棄。我國1990年11月頒布的乳與乳制品管理辦法第4條明確規(guī)定，乳牛在應用抗生素期間和停藥后5 d內的乳汁不得供食用[4]。

2 乳中常見抗生素種類

四環(huán)素類抗生素：金霉素、土霉素、四環(huán)素、強力霉素等；磺胺類抗生素：磺胺嘧啶、磺胺甲基嘧啶、磺胺甲噁唑、磺胺二甲基嘧啶等；氯霉素類抗生素：氯霉素，甲砜霉素，氟甲砜霉素等；大環(huán)內酯類抗生素：紅霉素、秦樂霉素、林可霉素、螺旋霉素和鹽霉素等；氨基糖甙類抗生素：鏈霉素、慶大霉素、二氫鏈霉素、新霉素、壯觀霉素等；β-內酰胺類抗生素：青霉素類、頭孢霉素類；喹諾酮：氧氟沙星、甲磺酸培氟沙星、替米考星等；其他抗生素：林可霉素、氯林可霉素、萬古霉素、桿菌肽等。

3 牛乳中抗生素殘留檢測方法

根據WHO提供的數據，歐盟藥典確定了食品中各種抗生素最大殘留量限制（MRL），同時歐盟規(guī)定食品中獸藥的殘留量必須與國際認可的其他法規(guī)（如國際食品法典委員會的法規(guī)）相一致。為了使原料乳和乳制品中抗生素殘留量符合MRL要求，乳牛場、乳制品廠、政府監(jiān)督部門都在努力尋求準確可行的抗生素檢測方法，許多大型化學試劑和儀器公司也在致力于開發(fā)抗生素殘留量的檢測方法和儀器。目前牛乳中抗生素殘留的檢測方法主要有：微生物受阻檢測法、理化檢測法、免疫學分析法。

3.1 微生物受阻測定法

微生物受阻檢測法，又稱微生物抑制實驗，抑菌圈試驗、渾濁度試驗均屬于此類，大量樣品中抗生素的殘留物測定通常采用MIT（Microorganism Inhibitory Test）法[8-10]。根據抗生素對特異微生物的生理機能、繁殖代謝的抑制作用來定性或定量確定樣品中抗微生物藥物殘留量，是檢測乳中抗生素較經典且應用較廣泛的方法。

3.1.1 TTC法

TTC法（trypheye tetrazolium chloride），即氯化三苯基四氮唑法，最早由Neel和Calbert二人在1955年提出，能檢出牛乳中青霉素含量為0.004 U/mL[9,11]。這是目前我國食品衛(wèi)生標淮中規(guī)定的檢查牛乳中抗生素殘留的檢測方法（GB/T4789.27-2003），如果牛乳中有抗生素存在，當乳中加入菌種（嗜熱鏈球菌），經培養(yǎng)后不增殖時，加入的TTC指示劑不發(fā)生還原反應，鮮乳仍呈無色狀態(tài)，判定為抗生素陽性；如果沒有抗生素存在，則加入菌種即行增殖，TTC被還原變成紅色，使樣品染成紅色，判定為抗生素陰性，一般在培養(yǎng)2.5 h以上可得出判定結果。

3.1.2 紙片法

紙片法，即PD法（Paper Disc），常用的紙片法有枯草桿菌紙片法和嗜熱脂肪桿菌紙片法。這兩種方法主要用來檢測牛奶中的β-內酰胺類抗生素。其操作過程基本相同：將一吸滿受檢乳樣的濾紙圓片放入一接種枯草桿菌的瓊脂平皿上，并放入一含有標準抗生素的陽性對照圓片。將培養(yǎng)皿在32℃下培養(yǎng)17～24 h，然后觀察有無抑菌圈，若要判定結果是否為真陽性，則需將乳樣在82℃下加熱2～3 min，冷卻，再重復試驗。該方法對乳樣中青霉素殘留的檢測限可達0.01 IU/mL。乳中的一些抗菌物質如溶菌酶、乳鐵蛋白等會影響試驗結果。而嗜熱脂肪桿菌紙片法僅用于檢測奶樣中β-內酰胺類抗生素，并能暗示是否還存在其它抑菌物質，檢測限可達0.008 IU以下。一般在4h內即可獲得有關乳中是否還存在β-內酰胺抗生素殘留的結果[14]。

3.1.3 Delvotest法（戴爾沃檢測法）

該方法屬于微生物測定法，其試劑是由荷蘭DSM公司生產并由AOAC認證[12]。原理是利用微生物—嗜熱芽孢菌在64℃條件下培養(yǎng)2.5～3 h后會產酸，酸引起指示劑BCP（溴甲酚紫）變成黃色；若樣品中不含有抗生素，培養(yǎng)后樣品呈黃色；若樣品中含有抗生素，嗜熱芽孢菌生長受到抑制而無法產酸，指示劑不變色。

3.1.4 ECLIPSE50試劑盒法

西班牙ZEU-INMUNOTEC公司生產的抗生素檢測試劑盒ECLIPSE 50是一種微孔板，每個微孔中含有散播了芽孢桿菌的瓊脂培養(yǎng)基和pH指示劑。當在（65℃±1）下培養(yǎng)微孔板時，孢子發(fā)育生長，進而降低了培養(yǎng)基的pH值，在pH指示劑的作用下，原來的藍（紫）色將會變?yōu)榫G-黃色。如果生鮮牛乳中的抗生素殘留濃度高于試劑盒的檢測限值，微生物的生長和酸的產生將會受到抑制，由于沒有酸生成，顏色將不會改變[13]。

3.1.5 管碟法

由Foster和Wood Ruff于1944年創(chuàng)建管碟法，其原理就是用含有敏感菌的瓊脂做成平皿，上面放小管，管中放已知抗生素標準溶液和待測溶液，經過培養(yǎng)后，抗生素標準溶液周圍不長細菌，即為抑菌圈，如待測溶液也出現抑菌圈表示含有抗生素。1958年，美國FDA將藤黃八迭球菌（Sarcinalntea）管碟法作為法定的方法，檢測青霉素的敏感度為0.01 U/mL[14]。

3.2 理化檢測法

理化檢測方法是利用抗生素分子中的基團所具有的特殊反應或性質來測定其含量，如高效液相色譜法、氣相色譜法、比色法和熒光分光光度法等。而牛奶中抗生素殘留檢測最為常用的理化檢測方法是高效液相色譜法和色譜質譜聯(lián)用技術，但其樣品前處理繁瑣，檢測費用較高，且不像微生物檢測法具有廣譜性。

3.2.1 高效液相色譜法

高效液相色譜（HPLC）是目前廣泛應用的一種理化檢測方法，它引入了氣相色譜理論，在技術上采用了高壓泵、高效固定相和高靈敏度檢測器，實現了分離速度快、效率高和操作自動化。高效液相色譜法測定牛奶中的藥物殘留都要經歷樣品處理（包括樣品的提取、脫蛋白、離心、層析柱凈化、衍生化等步驟）、殘留藥物的分離和殘留藥物的檢測[15-16]，薄海波等研究了超高效液相色譜-串聯(lián)質譜法測定牛奶中聚醚類抗生素殘留量[17]，范志影建立高效液相色譜法測定牛奶中四環(huán)素、土霉素、金霉素、強為霉素等4種抗生素殘留的方法[18]。

蔣定國等利用高效液相色譜法測定牛奶中磺胺二甲嘧啶，此法樣品前處理步驟較簡單，凈化效果好，回收率高，精密度好，磺胺二甲嘧啶的最小檢出濃度為1.2 μg/L[19]。而反相HPLC發(fā)展最快,目前已成為大多數抗生素殘留的常規(guī)分析方法。彭莉等報道了用高效液相色譜法檢測牛乳中氯霉素的殘留量,采用乙酸乙酯提取牛乳中殘留的氯霉素，用紫外檢測器在278 nm檢測樣品，平均回收率為94.8%，變異系數＜12.0%,此方法樣品前處理簡單，回收率高，實用性強，檢驗靈敏度高，重現性好，檢測數據準確可靠，可作為牛乳中氯霉素殘留檢測的確證方法[20]。

3.2.2 聯(lián)用技術

各種分析技術聯(lián)用是現代獸藥殘留分析及整個分析化學方法上的發(fā)展特點。常用的聯(lián)用技術有薄層液相色譜和質譜聯(lián)用（TLC-MS）、氣相色譜和質譜聯(lián)用（GC-MS）、液相色譜和質譜聯(lián)用（LC-MS）、毛細管區(qū)域電泳和質譜聯(lián)用（CIE-MS）、液相色譜和核磁共振波譜聯(lián)用（LC-NMR）、超臨界流體色譜和質譜聯(lián)用（SFC-MS）等。

1989年，Voyksner等人基于液譜—熱噴霧質譜（LC-TS-MS）方法提出了一種簡單快速檢測牛乳中青霉素G的分析方法[21]。2001年Bruno研究出一種準確的檢測方法，可精確分離和定量乳中低于美國和歐盟規(guī)定耐受量的10種允許使用的β-內酰胺類抗生素[22]。

3.3 免疫分析法

免疫分析法的基本原理是以抗原或半抗原和抗體特異性結合為抗原—抗體復合物的以免疫反應為基礎的生化測試技術。目前應用的殘留免疫分析技術可分為2個基本類型。

（1）相對獨立的分析方法，即免疫測定法（IAS），包括放射免疫測定法（RIA）、酶聯(lián)免疫吸附測定法（ELISA）、固相免疫傳感器等。競爭ELIsA法應用于牛奶中抗生素的檢測比較廣泛的直接競爭ELISA.

（2）免疫凈化法。將免疫分析技術與常規(guī)理化分析技術聯(lián)用。其中最常用的是免疫親和色譜法（IAC）[23]。

3.3.1 SNAP快速抗生素測定儀

SNAP快速抗生素測定法，是酶聯(lián)免疫分析法（ELISA）的一個變換形式。它是利用競爭性原理，使樣品內的抗生素與內置抗生素標志物競爭性地與固定的抗體或廣譜受體結合，然后進行沖洗和顯色。最終的反應結果是當顏色越深或光度強時表示陰性，反之表示陽性。Snap屬于快速的檢測方法，反應時間不到10 min,正因為快速其檢測面就相對比較窄，準確率相對于微生物受阻檢測法低一些,而且所使用的儀器和試劑成本很高[24-25]。

SNAP操作步驟：加乳樣于樣品管中，搖勻，加熱樣品和檢測板5 min，加入乳樣于樣品孔中，當激活圓環(huán)開始退卻時按snap鍵，反應4 min由snap讀數儀讀取并打印結果[26]。

3.4 分子印跡技術

分子印跡技術以目標待測物為模板分子，將具有結構上互補的功能化聚合物單體通過共價或非共價鍵與模板分子結合，并加入交聯(lián)劑進行聚合反應。反應完成后將模板分子洗脫出來，形成的一種具有固定空穴大小和形狀及有確定排列功能團的交聯(lián)高聚物。這種交聯(lián)高聚物即為分子印跡聚合物（Molecular Imprinting Polymers,MIP）[27]。待測物質由于與MIP的識別位點在形狀、大小和功能基團的定位方面吻合而被特異性識別，因此在特異性上可與生物抗體相媲美，同時具有一定的機械和化學強度，對酸、堿、有機溶劑、溫度和壓力均有一定的耐受性，且比生物抗體易于合成和貯存，是分子識別理想的工具，在SPE[28]、藥物的手性分離[29]、傳感器[30]、模擬抗體和模擬酶[31]、農藥檢測等方面有廣泛的應用。

王慧等應用分子印跡方法合成了對青霉素有特異性吸附能力的印跡聚合物PenG-MIP，與本尼迪特（Benedict）試劑結合分析確定了，PenG-MIP在牛乳中的吸附平衡時間為6 h，選擇性吸附實驗表明在牛乳中青霉素印跡聚合物對青霉素表現出高特異性。用一定量顆粒吸附處理含有青霉素的牛乳，再進行發(fā)酵活性實驗，通過顆粒的用量及發(fā)酵情況確定乳中青霉素的殘留量，實現分子印跡技術用于乳中青霉素殘留的快速定量檢測，檢測下限為5 μg/L或以下，結果準確度高，操作簡便，且PenG-MIP顆粒可以反復使用，極大的降低了檢測的成本[32]。

4 結束語

縱觀以上牛乳中抗生素的殘留檢測方法，微生物受阻法可靠性高、操作簡單、費用低，但必須經過幾小時的培養(yǎng)過程才能觀察到結果。理化檢測法敏感性較高，準確度高，但前處理較復雜，費用較高。免疫受體檢測法雖然速度快，靈敏度高，特異性強，但容易出現假陽性。隨著廣大消費者對無抗奶需求呼聲不斷提高，牛乳抗生素殘留檢測方法已成為乳品企業(yè)所面臨的難題，需要開發(fā)出快速且靈敏度高的抗生素檢測方法，來提高乳品的質量和乳品企業(yè)的競爭力。

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Study on the residues and detected methods of antibiotics in milk

CHEN Yun1,LI Hong-liang1,ZANG Dong-jie1,ZHAO Shu-ping1,YU Jing-hua1,2
（1.Inner Mongolia Mengniu Dairy Industry Co.Ltd.，Hohhot011500，China；2.Tianjin University of Science and Technology，Tianjin 300457，China）

In this paper,the residues and categories of antibiotics existed in milk were introduced.The different detected methods were described and compared at home and abroad,from which we can obtain theories to develope new detected method for antibiotics in the milk.

antibiotics；milk；detected methods；residues

TS252.7

B

1001-2230（2012）09-0035-04

2012-03-22

陳云（1980-），男，碩士，研究方向為乳及乳制品研究開發(fā)。