蛋白磷酸酶1與Ca2+/鈣調素依賴性蛋白激酶Ⅱ在心肌病中研究進展

廖儒佳，曹雯雯，張 偉

(南通大學醫學院，江蘇南通 226001)

心肌疾病是指除心臟瓣膜病、冠狀動脈粥樣硬化性心肌病、高血壓心臟病、肺源性心肌病、先天性心血管病和甲狀腺功能亢進性心肌病等以外的以心肌病變為主要表現的一組疾病，癥狀常表現為心力衰竭。1995年世界衛生組織和國際心臟病學會(WHO/ISFC)工作組根據病理生理學將心肌病分為四型，即擴張型心肌病(dilated crdiomyopathy，DCM)、肥厚型心肌病(hypertrophic cardiomyopathy，HCM)、限制型心肌病(restrictive cardiomyopathy，RCM)及致心律失常型右室心肌病(arryhythmogenic right ventricular cardiomyopathy，ARVC)。但不定型的心肌病(unclassified cardiomyopathies，UCM)仍保留。隨著研究的發展此分類已顯示出很多缺陷，2006年美國心臟病學會新定義心肌病為由各種病因主要是遺傳因素引起的一組非均質的心肌病變，包括心臟機械和電活動的異常。心肌病可以單純局限于心臟，也可以是全身系統性疾病的一部分，最終導致心力衰竭或死亡［1］。

目前心肌病的分子和細胞生物學研究取得了較大進展。研究發現DCM由心肌結構蛋白如肌動蛋白、α-原肌球蛋白等突變所致，采用候選基因篩查和連鎖分析策略已定位26個染色體位點與該病相關，并已從中成功鑒定出22個致病基因［2］。HCM是由多種編碼心肌肌小節的收縮蛋白質基因突變引起的，已將其致病基因定位在9個不同的染色體上，至少15種HCM致病相關基因及450種以上致病性基因突變，且已確認11種基因突變與該病有關［2］。RCM較少見，有報道肌鈣蛋白I的突變可引起限制性及肥厚型心肌病［3］。目前ARVC的研究認為其系第8號染色體上4個基因突變所致，分別是蘭尼堿受體(Ryanodine receptor，RyR)、代司莫普拉肯、Plakophillin-2和轉錄生長因子-β調節基因［2］。

1 PP1的相關研究

目前研究顯示蛋白磷酸酶家族包含 PP1、PP2A、PP3 (PP2B/calcineurin)、PP4、PP5、PP6與PP7，而PP1、PP2A和PP3是研究最深入的3種蛋白磷酸酶，其中PP1與PP2A是許多細胞內最豐富的蛋白磷酸酶，尤其PP1在心肌細胞肥厚與心力衰竭的病理生理中發揮極其重要的作用［4］，已發現終末期心力衰竭病人的PP1表達明顯增加［5］，而其內源性抑制劑及其下游的調控蛋白的表達明顯下降［6］。PP1(35-38 ku)是最保守的真核生物蛋白質之一，其作為一種重要的蛋白磷酸酶參與細胞許多重要生理功能，包括轉錄、翻譯、代謝、調控Ca2+-ATPase活性等。

1.1 PP1的結構與分布 真核生物基因組有1～8個基因是編碼PP1，哺乳動物有3個PP1基因，分別編碼PP1α，PP1γ和 PP1β/δ亞型，這些亞型被廣泛表達且它們約有0.89的相似氨基酸序列，這些亞型主要不同之處是其N端與C端［7-8］。1995年Goldberg等［9］首次報道了PP1催化亞基的三維結構，從分子水平上看，其全酶由1個固定的催化亞基(具有磷酸化的活性)和估計多達100個調控亞基組成的異二聚體。1997年Egloff等［10］研究了PP1γ的晶體結構，發現其催化亞基環繞周圍形成3個凹槽，分別為:酸性凹槽(acidic groove)、疏水凹槽(hydrophobic groove)和C端凹槽(C-terminal groove)。3個凹槽形成Y字型結構，其兩臂之間夾著一個重要的結構區，即β12/β13 loop，該環是同族絲氨酸/蘇氨酸蛋白磷酸酶的共有結構，研究表明該區域為抑制劑結合區。從細胞水平上看、PP1α在細胞質與細胞核均有分布，且聚集于未知核小體中，PP1γ在細胞質與細胞核均有分布，且聚集于核仁中，PP1β/δ則在細胞核與細胞質中均廣泛分布［11］。從組織水平上看，PP1α、PP1γ和PP1β/δ在哺乳動物組織中廣泛分布于腦、肝、骨骼肌、腎、小腸、心臟、肺等，其中PP1α除在心臟和骨骼肌的表達水平太低無法檢測外，在其它組織均有分布;PP1γ則在腦、小腸和肺中表達最高;PP1β/δ除在骨骼肌的表達水平太低無法檢測外在其它組織也有分布［12］。值得注意的是PP1α與PP1γ在心臟中的表達極低，而 PP1β/δ表達則相對較高，因此可以推測PP1β/δ亞型在心肌疾病的發生與發展中可能起重要作用。事實上3種亞型中目前發現只有PP1β/δ在心衰的心臟中表達明顯升高，且其主要是通過調控肌漿網(sarcoplasmic reticulum，SR)中受磷蛋白(phospholamban，PLN)的絲氨酸16位磷酸化調節心肌細胞Ca2+，參與調節心肌細胞功能［13］。研究顯示心肌組織特異性的過表達PP1β/δ shRNA，抑制PP1β/δ的表達，能明顯改善心衰心臟中SR中Ca2+穩態平衡［14］。

1.2 PP1與心肌病 PP1是心臟功能重要的負調控蛋白，在心臟中PP1作為主要的磷酸酶負責SR中PLN去磷酸化，而PLN主要參與SR中Ca2+-ATPase活性的調控，PLN在去磷酸化狀態能抑制Ca2+-ATPase活性，PLN偶聯β腎上腺素受體磷酸化其蛋白激酶A(protein kinase A，PKA)的絲氨酸16和CaMKⅡ上的蘇氨酸17位點能減輕其抑制作用，進而增加Ca2+進入SR的量，增加心肌收縮力［15］。已發現PP1的活性在心衰病人中增加導致PLN磷酸化減少，因此減少了Ca2+-ATPase的活性，并抑制了PLN誘導SR中Ca2+轉運的功能，從而影響心肌細胞功能;有趣的是，RyR在心衰病人心臟中高度磷酸化，從而導致Ca2+依賴的活性增加并進一步減少SR中Ca2+負荷。因此，心肌細胞SR中PLN磷酸化的減少與RyR磷酸化程度增加這個自相矛盾的兩方面可能反映了激酶與磷酸酶在微環境中的復雜作用，也反映了PP1在心臟中復雜的調控作用［4］。

一組研究通過小鼠模型證實心臟中過度表達PP1(3倍)導致心臟收縮功能減弱，引起擴張型心肌病和過早死亡［15］，而過表達PP1抑制劑1和2(inhibitor 1 or 2 of protein phosphatase 1，Inh-1，Inh-2)均能有效地抑制心肌肥厚和心衰的發生/發展，并可以逆轉由于PP1過表達引起的心肌肥厚和心功能缺失［16-20］。Rajashree等［21］發現PP1通過磷酸化心肌細胞的肌球蛋白輕鏈2潛在的引起心肌等長張力增加0.2～0.3，而過度磷酸化導致心肌肥厚。Singh等［22］發現蛋白激酶 A固著蛋白(A-kinase anchoring protein 18，AKAP18)通過直接影響Inh-1調節PP1的活性參與調控心肌功能。而有研究認為熱休克蛋白20(small heat shock protein 20，HSP20)增強心肌基礎功能的主要原因在其能抑制PP1活性［23］。因此越來越多的證據表明設法抑制PP1活性已成為心肌病的潛在治療方案。然而目前對這一觀點還存在部分疑問。Grote-Wessels等［24］就報道了過表達Inh-2并沒有使小鼠心功能在壓力過負荷誘導的心肌肥厚中發生改善，事實上Inh-2過表達反而加速了心功能惡化。作者推測這是因為長期過表達Inh-2而長期抑制PP1活性，導致機體出現負反饋調節，而惡化心功能。因此考慮到PP1是一種在整個機體中作用廣泛的蛋白，短期抑制PP1活性，不管是通過表達其內源性抑制蛋白Inh-1與Inh-2或應用外源性抑制劑如tautomycetin都能改善心功能，但如果長期維持勢必對心功能產生不良影響。但什么情況下長期表達、什么時候用短期治療，這個度怎么判斷，目前來看還是一個問題。其次為什么長期表達會發生PP1的負反饋調節，它的調控機制是什么，也是未來值得研究的方向。此外由于外源性的PP1阻斷劑能同時阻斷蛋白磷酸酶2A(PP2A，一種同族的蛋白去磷酸化酶，調節心肌細胞收縮性)活性，并導致細胞死亡，因此開發PP1特異性抑制藥，也成為未來研究的焦點。

2 CaMKⅡ的相關研究

目前Ca2+/鈣調素依賴性蛋白激酶家族(Ca2+/calmodullin-dependent protein kinase，CaM Kinase)包括 CaMKⅠ、CaMKⅡ、CaMKⅢ和CaMKⅣ。除CaMKⅢ主要調控延胡索酸2外，其余3種Ca2+/鈣調素依賴性蛋白激酶均是多功能蛋白激酶。CaMKⅠ是一種單體酶，主要位于細胞質，但其C末端截斷形式也能轉位到細胞核磷酸化并激活一系列的轉錄因子的表達。目前發現其在心臟組織也有表達，但在心肌肥厚的病理變化中卻并沒有發現增加，因此其在心肌疾病中的作用還有待進一步研究。CaMKⅣ也是一種單體酶，目前發現其主要分布于神經元、T淋巴細胞及睪丸，在心臟中還沒有檢測到。CaMKⅣ主要位于細胞核中在轉錄調控及基因表達中起重要作用。CaMKⅡ(-600 KD)是一種同源或異源的多體酶，廣泛分布于哺乳動物的心臟、骨骼肌、肺、肝臟、胰腺、視網膜、腎、甲狀旁腺、乳腺、子宮等。研究顯示CaMKⅡ作為一種重要的蛋白激酶主要參與與Ca2+信號有關的細胞功能調控，包括氨基酸和脂質代謝、離子通道/受體及神經遞質的合成與釋放、轉錄因子、翻譯因子、細胞骨架蛋白和Ca2+平衡等。它是心臟中最主要的CaM Kinase亞型，CaMKⅡ在心臟中發揮了極其重要的功能，特異性過表達CaMKⅡ在心臟中或離體心肌細胞中均能明顯調控興奮收縮耦聯作用［25］。

2.1 CaMKⅡ的結構和分布 CaMKⅡ全酶由3個關鍵區域組成的亞單位構成，這3個區域分別是:連接區-與復合體直接相連;調控區-控制酶的活性和自動抑制作用;催化區-行使CaMKⅡ功能。目前研究發現CaMKⅡ有超過30個由可變剪接產生的亞型，但其在心臟中研究最廣泛的是分別由4種不同的基因(α、β、γ、δ)編碼的亞型，并且目前發現很多可變剪接產生的亞型都可歸入這4種亞型細分亞型。神經組織中主要表達CaMKⅡα和CaMKⅡβ，嚙齒類海馬中CaMKⅡα和CaMKⅡβ占到總蛋白量的0.2。CaMKⅡγ和CaMKⅡδ則幾乎在機體的所有組織中表達。目前發現哺乳動物心臟中主要是CaMKⅡδ亞型，并且主要是CaMKⅡδA、 CaMKⅡδB、CaMKⅡδC 3種，這3種亞型由于其結構與細胞定位不同而發揮不同功能。其中CaMKⅡδB的可變區1中包含一個由11個氨基酸組成的核定位信號，因此主要位于細胞核，其主要涉及心鈉素(atrial natriuretic factor，ANF)基因表達的調控，且它似乎也是成人心臟中最主要的CaMKⅡ亞型。而CaMKⅡδC由于缺乏核定位信號而主要位于細胞質中。CaMKⅡδB在心肌肥大基因的表達中具有重要作用，在心臟及心肌細胞中過表達CaMKⅡδB能保護心臟免受缺血再灌注誘導的損傷［26］，且在CaMKⅡδB轉基因小鼠中，CaMKⅡδB的過表達促進心肌肥厚基因的表達，如myocyte enhancer factors(MEF2)和 histone deacetylase 4(HDAC4)等，最終引起心肌肥厚和心力衰竭［27-28］。CaMKⅡδC通過磷酸化一系列Ca2+調控蛋白而影響興奮收縮偶聯，在CaMKⅡδC轉基因小鼠中，因CaMKⅡδC過度表達激活胞質內的RyR2，使得Ca2+過度釋放，而導致心臟電-機械活動異常，心肌過度肥厚，并造成擴張性心肌病和心力衰竭，且過表達CaMKⅡδC會誘導心肌細胞凋亡［29］。CaMKⅡδA不含核定位信號，主要分布在心臟細胞T管區，最初發現在神經元表達［30］，后發現主要表達于新生心肌細胞，且一個月后其表達逐漸消失［31］。研究發現轉基因小鼠中過表達CaMKⅡδA能增強興奮收縮偶聯引起的心肌過度收縮而誘導心衰，此外，其活性上調伴隨著心肌細胞增大，肌原纖維重構且激活一系列心肌肥大基因如ANF及肌球蛋白重鏈［27，32］。

2.2 CaMKⅡ與心肌病 心臟組織主要表達CaMKⅡδ亞型，分布在心肌細胞T管終未池、肌漿網、內質網和細胞核等，通過磷酸化數種Ca2+調節蛋白，如RyR、phospholamban、L-型鈣通道、肌漿網Ca2+-ATP酶等調節心肌細胞電興奮收縮偶聯。另外，CaMKⅡδ也參與基因表達長期調節(電興奮-轉錄調控)，而參與各種內外源性刺激引起的心臟細胞肥大性生長，肌節結構重組及胚胎基因表達，最終引起心肌肥厚而導致心力衰竭。CaMKⅡδ過度激活導致心肌細胞RyR2功能異常，引起靜息狀態下細胞中Ca2+通過RyR從SR漏出到細胞質內，使Ca2+濃度升高，SR鈣儲備量下降，使心臟收縮時從SR釋放的Ca2+減少，而影響心肌收縮力，并相應增加心臟舒張時SR的Ca2+量，易導致延遲后去極化等心率失常發生。CaMKⅡ的激活還伴隨著細胞內氧化態改變，并上調與CaMKⅡ有關的組成性激活突變基因酶，此類酶參與心肌病中多個病理通路包括激活一類影響心肌細胞興奮收縮偶聯及細胞生存的酶如離子通道、調控Ca2+穩態的蛋白及與炎癥基因表達有關的轉錄因子等［33-34］。

無論在多種原因引起的終末期心肌病病人，還是在結構性心肌病的動物模型心臟中，CaMKⅡδ蛋白含量和活性均升高，而選擇性地抑制心臟CaMKⅡδ則減輕多種模型心肌病變和心力失常，改善心肌收縮。Zhang等［35］通過應用小鼠心肌CaMKⅡδ抑制模型證實抑制CaMKⅡδ能夠極大地阻止βAR過度表達和心肌梗死。Satoru等［36］發現過表達CaMKⅡ影響了一系列鈣調控蛋白導致Ca2+穩態被破壞進而增加活性氧的量。Respress等［37］發現在心衰的病人及小鼠模型中CaMKⅡ主要磷酸化RyR2絲氨酸2814位點進而導致Ca2+穩態失衡。CaMKⅡ磷酸化RyR2導致心衰的發展還跟心衰的類型有關系，只有在非局部缺血導致的心衰病人或壓力過負荷誘導的心衰中CaMKⅡ磷酸化RyR2調控Ca2+的穩態，且選擇性敲除RyR2的絲氨酸2814位點明顯延緩心衰的進程。與此相反，局部缺血導致的心衰病人或急性心肌梗死小鼠模型中卻并沒有觀察到這種現象。因此，CaMKⅡδ的激活在心肌肥厚和重構中起重要作用，它可能成為臨床治療心肌肥厚和心力衰竭的重要靶蛋白。因此抑制CaMKⅡδ的過度激活已經成為心肌病潛在的治療靶點。但目前關于β-腎上腺素是否直接激活CaMKⅡδ還不清楚，目前只觀察到部分β-腎上腺素對興奮收縮偶聯的作用由CaMKⅡδ調控，且雖然有各種CaMKⅡδ抑制劑如KN-93和KN-62等，但目前臨床相關的CaMKⅡ抑制劑還不存在。

3 PP1與CaMKⅡ在心肌病治療中的比較。

綜上所述，PP1與CaMKⅡ是一對去磷酸化與磷酸化蛋白質。雖然它們都是多功能蛋白酶，且都具有廣泛的生理作用，但在調節心臟功能中，都是直接或間接參與對第二信使Ca2+的調控。心肌細胞內Ca2+濃度與心臟收縮和舒張功能密切相關，早期心肌細胞Ca2+濃度升高可使心肌收縮性加強，但Ca2+濃度持續升高將導致舒張功能障礙。此外胞質內Ca2+濃度升高還會引起一系列蛋白功能改變，進一步使胞質內Ca2+濃度增加，形成惡性循環，造成Ca2+超載，Ca2+超載可啟動Ca2+介導的信號轉導，并參與心肌肥厚的發生/發展。因此對心肌病的治療其中一個關鍵點就是調節Ca2+穩態。在心肌病治療中雖然單獨抑制PP1或者CaMKⅡ均能改善細胞中Ca2+的穩態，但對PP1與CaMKⅡ的調控可能不能只單獨抑制某一種，未來的治療策略應該綜合考慮兩者的情況，同時加以調控。并且現在關于PP1與CaMKⅡ之間是否存在相互調節作用還有待研究。可以想象如果它們之間存在著相互調節，那么對這一通路進行調控應該更具有應用價值。

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