線粒體與心肌缺血/再灌注損傷

李雪麗，劉建勛

(1.中國中醫科學院西苑醫院實驗研究中心，北京 100091;2.北京中醫藥大學，北京 100029)

心肌缺血/再灌注(ischaemia/reperfusion，I/R)可引起心肌代謝功能紊亂，并導致細胞嚴重受損甚至死亡，大量研究證明線粒體對該過程起重要的調控作用。I/R破壞線粒體穩態平衡進而引起結構和功能的改變是導致I/R損傷的關鍵因素，研究和闡明線粒體參與I/R損傷的機制，對心肌I/ R損傷線粒體保護新途徑的發現和減輕I/R損傷，改善心梗患者的預后具有重要意義。

1 心肌缺血/再灌注導致的線粒體失衡

1.1 I/R損傷中線粒體ROS的大量生成 過去幾十年，大量研究證明，心肌缺血時有少量活性氧(reactive oxygen species，ROS)生成，而再灌注初期會產生大量的ROS，線粒體不僅是ROS損傷的主要靶點更是ROS產生的主要位點。心肌細胞內，約0.2%～2.0%的分子氧通過復合物Ⅰ和復合物Ⅲ的電子傳遞生成超氧化物。缺血時產生的少量ROS可導致電子傳遞鏈的破壞并促進ROS的進一步產生;再灌注時氧濃度的瞬間增高加上高效的氧化磷酸化作用，促使線粒體ROS爆發性生成。通過抑制上游位點電子傳遞(尤其是復合物Ⅰ)或使用解偶聯劑可減少I/R損傷，這種保護作用可能是通過減少線粒體ROS的產生實現的。

近年來，研究者提出了線粒體通過增加自身ROS對最初生成的ROS起正反饋作用的觀點，被稱作是ROS誘導的ROS釋放(ROS-induced ROS release，RIRR)［1］，最初升高的ROS可誘導線粒體通透性轉換孔(mitochondrial permeability transition pore，mPTP)的開啟和線粒體去極化，從而產生源于線粒體電子傳遞鏈短暫的ROS爆發性生成，采用米酵菌酸抑制mPTP則能夠同時抑制線粒體膜電位(△Ψm)的下降和第二階段ROS的爆發性生成［1］;另外，Aon等［2］發現線粒體內膜陰離子通道(inner membrane anion channel，IMAC)與RIRR密切相關，IMAC抑制劑能夠阻止ROS的爆發性生成，此外，該通道受線粒體苯二氮卓類受體(mitochondrial benzodiazepine receptor，mBzR)調節，mBzR拮抗劑也能夠抑制RIRR。由RIRR途徑產生的ROS可導致△Ψm下降和動作電位的穩定喪失，被認為是新發現的導致I/R損傷的重要介質。

1.2 線粒體鈣穩態的失衡 線粒體對心肌細胞內Ca2+穩態的調節發揮關鍵作用，I/R所引起的線粒體功能障礙和線粒體Ca2+超載是導致心肌細胞死亡的重要原因。正常情況下，心肌細胞肌質網/內質網(sarcoplasmic/endoplasmic reticulum，SR/ER)Ca2+釋放位點附近分布有豐富的線粒體，可通過Ca2+單輸送通道捕獲大量的Ca2+，該轉運機制僅通過△Ψm來驅動，不與其他離子交換或共轉運。線粒體Ca2+濃度對細胞質Ca2+的迅速回應是通過Na+/Ca2+交換(Na+/ Ca2+exchanger，NCX)和H+/Ca2+交換(H+/Ca2+exchanger，HCX)實現的，二者分別通過Na2+和H+進入線粒體驅動Ca2+的排出，維持線粒體基質、細胞質和SR/ER的內鈣穩態。然而，當單輸送通道攝入的Ca2+濃度增加至NCX活力被飽和時，就會導致線粒體Ca2+超載。

研究證明，缺血時線粒體Ca2+濃度有少量升高，Griffihs等［3］觀察到這可能與NCX逆轉有關，采用Clonazepam(一種線粒體NCX抑制劑)可抑制缺血時線粒體Ca2+的增加;再灌注過程中線粒體Ca2+的濃度可升高4－5倍，而且這種高水平可以維持到再灌注后1h以上，這時再給予Clonazepam則增加線粒體Ca2+水平，這是因為氧的恢復使NCX的功能也逐漸恢復正常。目前研究認為，缺血時呼吸作用底物和氧利用受限造成的△Ψm下降、細胞質Ca2+濃度的升高以及mPTP的開啟均會影響線粒體Ca2+平衡。Griffihs等［3］發現環孢素A(cyclosporin A，CsA)(一種mPTP抑制劑)可通過降低mPTP對Ca2+的敏感性對心肌細胞起保護作用，但Juhaszova等［4］的研究證明Ca2+濃度的增加并不能增強mPTP對ROS的敏感性。因此關于Ca2+介導心肌細胞mPTP開啟作用的觀點尚存在爭議，需要進一步的體內實驗來證實。

1.3 線粒體膜通透性改變

1.3.1 內膜通透性改變 線粒體內膜(inner mitochondrial membrane，IMM)通透性極低，幾乎所有的離子甚至質子都不能通過，基質成分和代謝物必須在載體蛋白或高選擇性通道的協助下才能實現跨膜運輸，這種“不透性”對ATP的生成和△Ψm的維持起重要作用。關于內膜在線粒體膜通透性改變過程中的作用是有爭議的［5－6］，但大多數研究認為這種作用是存在的，mPTP是內膜實現通透性轉換的主要機制。mPTP是一種多蛋白復合體，主要由位于內膜的腺苷酸轉運蛋白(adenine nucleotide translocator，ANT)、外膜的電壓依賴性陰離子通道(voltage-dependent anion channel，VDAC)和基質的親環素D(cyclophilin D，Cyp-D)及細胞質的己糖激酶(hexokinase，HK)組成，所形成孔道具有電壓依賴性和高傳導性，全部開啟時孔徑為3 nm，可允許分子量小于1.5 kDa的物質被動擴散通過線粒體內膜。mPTP的不可逆高水平開放，直接導致△Ψm不可逆降低，氧化磷酸化解耦聯，離子平衡失調，線粒體腫脹和ATP水解，最終導致細胞死亡［7］。

大量研究證明，心肌I/R可誘導mPTP開放，并且該現象更多發生于再灌注初期，因為該階段線粒體ROS的爆發性生成、Ca2+迅速聚集以及pH值的逐漸升高均為mPTP的開放提供了最佳環境。mPTP的開放導致的IMM通透性增加及細胞色素C(cytochrome C，CytC)、凋亡誘導因子(apoptosis-inducing factor，AIF)等釋放，介導了一系列細胞骨架、細胞膜及細胞核有關的蛋白質切割水解，若mPTP持續高水平開放則直接導致心肌細胞壞死;一定程度的開放和隨后的及時關閉可致使細胞凋亡［7］。

1.3.2 外膜通透性改變 正常情況下，線粒體外膜(outer mitochondrial membrane，OMM)對膜間隙蛋白是不通透的，通過檢測典型膜間隙蛋白(如CytC，AIF)的亞細胞定位，可間接反應OMM的通透性變化。進一步的研究表明［8－10］，當OMM通透性增加時，procaspases、Smac/Diablo、Omi/Htr2A和EndoG等關鍵性蛋白也被釋放到細胞質并轉移到核內或與內質網上的受體相互作用，通過多種途徑參與調節細胞的死亡過程，其中包括caspase的激活，代謝改變，氧化磷酸化破壞，非caspase依賴性的細胞凋亡等。CytC是最常見的線粒體釋放蛋白之一，可與Apaf-1、dATP及caspase-9結合成凋亡復合體，激活caspase-9及下游效應物，最終導致細胞死亡。AIF是非caspase依賴性效應物，釋放后快速轉移至細胞核使染色質凝聚和DNA片段化，有研究報道［11］在I/R心肌細胞核碎片和胞質中檢測到了AIF，缺血預處理可減弱AIF的釋放。Bahi等［12］發現缺血可誘導心肌細胞線粒體EndoG的釋放及核轉移，用特異性siRNA置換EndoG可減少DNA片段化，但也有研究顯示EndoG缺失的小鼠其細胞死亡和DNA斷裂沒有明顯變化［13］，從這些小鼠分離到的細胞對各種凋亡刺激的易感性沒有明顯差異［14］。因此，EndoG在I/R心肌細胞凋亡中的作用還需要深入的研究。

1.4 線粒體形態的改變 近年來，隨著熒光成像和三維成像技術的發展，對線粒體形態的認識也更加深入。線粒體的管網狀組織是高度動態化的，通過持續的、相對獨立的分裂和融合事件維持的動態平衡對應答細胞不同生理需求具有非常重要的意義。

最近的研究證明，心肌I/R損傷與線粒體的形態變化相關，I/R過程中線粒體分裂融合的動態平衡被破壞，線粒體趨向于分裂并發生片段化。Brady等［15］對培養的HL-1細胞模擬缺血刺激，結果發現嚴重的線粒體片段化，復氧時也發生同樣變化，并證明片段化的發生與發動蛋白相關蛋白1 (dynamin-related protein-1，Drp1)的活化和線粒體轉移相關，給予SB203580(p38MAPK藥理抑制劑)可使線粒體再融合和恢復管網狀結構。目前，缺血誘導的細胞線粒體片段化機制還不清楚，可能與細胞鈣超載、ROS的產生和mPTP的開放有關。Plotnikov等［16］采用抗氧化劑能夠抑制缺血誘導的線粒體分裂。Hom等［17］發現毒胡蘿卜內酯(內質網Ca2+攝取抑制劑)或KCl引起的細胞鈣超載可促進心肌細胞線粒體分裂增加。Cereghetti［18］和 Han等［19］進一步研究顯示細胞內鈣超載可分別通過激活磷酸酶、鈣神經素或激活Ca2+/ CaMKIα途徑使Drp1去磷酸化而活化并轉移到線粒體誘導線粒體分裂。此外，也有研究證明［20］，mPTP的開放可能導致Drp1介導的線粒體分裂，相反抑制線粒體分裂或促進線粒體融合的同時mPTP的開放程度減弱，因此認為該機制也參與了I/R心肌保護作用。

線粒體的分裂、融合過程受多種蛋白的精確調控，Mfn1和Mfn2是參與線粒體外膜融合的關鍵蛋白，內膜的融合主要是由Dynamin家族蛋白Mgmlp/OPA1介導，Drp1/Dnmlp、Fisl/Fislp、Caf4p和Mdvlp參與線粒體分裂的調控。目前，抑制I/R過程中線粒體片段化的新策略之一是通過干預關鍵蛋白的表達。Ong等［20］用線粒體融合蛋白Mfn1、Mfn2及Drp1K38A(Drp1的顯性突變結構)轉染HL-1細胞，結果顯示管網狀形態的線粒體有所增加，細胞I/R損傷減弱;Chen等［21］研究發現，缺血誘導的心肌H9c2細胞線粒體分裂與線粒體融合蛋白OPA1的水平降低有關，但OPA1的過表達卻不能保護缺血誘導的細胞凋亡。

目前，線粒體形態變化與疾病發生相關性的研究仍是熱點，深入闡明線粒體分裂與I/R過程中鈣超載、ROS產生及mPTP的開放之間的相互作用，將為心肌I/R損傷的防治提供新的途徑。

2 線粒體在心肌缺血/再灌注損傷中的保護作用

2.1 線粒體ATP敏感性鉀通道的保護作用 線粒體ATP敏感性鉀通道(mitochondrial ATP-sensitive K+，mKATP)的生理作用是一方面維持線粒體內K+平衡，從而控制線粒體基質容積的改變;另一方面通過K+的再攝取部分補償質子泵產生的電荷轉移，從而維持跨膜電位差和pH梯度的穩態。大量研究認為，mKATP開放具有心肌保護作用，mKATP開放劑可模擬缺血預處理的心肌保護效應，相反給予阻斷劑保護作用減弱或消失。據報道，mKATP的開放可減少線粒體Ca2+的攝入和mPTP的開放［22］，也能夠增加電子傳遞鏈ROS的產生(短暫缺血和再灌注時產生的低水平的ROS被認為在IPC中起重要作用)［23－24］。此外，mKATP開放后，K+內流線粒體內滲透壓升高，基質容積增加，并直接影響能量代謝，促進ATP的生成，這一過程對I/R過程中細胞的自身保護也起到積極作用。

2.2 線粒體通透性轉換孔的保護作用 目前，mPTP被認為是防治心肌I/R損傷的重要靶點，大量實驗證明，通過直接干預孔道組成成分或間接減少孔道開啟誘因(如ROS、Ca2+和pH)，抑制mPTP的開啟，對心肌I/R損傷具有明顯的保護作用［25－26］。

Cyp-D是mPTP的主要成分，對mPTP的開放起關鍵調控作用，缺失Cyp-D的小鼠對Ca2+和氧化應激誘導的mPTP開放更具有抵抗力，I/R損傷也有所減少［27］。CsA是Cyp-D抑制劑，研究表明CsA對心肌I/R損傷具有同樣的保護作用，可減少缺氧/復氧誘導的心肌細胞死亡［28］，減小I/R心肌梗死面積［29］。研究證實，IPC的保護作用與其抑制再灌注初期mPTP的開放密切相關。Javadov等［25］采用3H-DOG技術，證明了IPC能夠抑制再灌注初期mPTP的開放，并促進其隨后的關閉。目前，mPTP的結構成分尚未完全確定，對其結構和功能的深入研究將有利于闡明mPTP參與I/R損傷的作用機制和新靶點發現。

3 展望

綜上所述，線粒體的完整性對心肌細胞的存活至關重要。心肌I/R過程使線粒體各種穩態平衡均發生嚴重改變，并且這些因素相互影響，形成惡性循環，從多種途徑參與了心肌I/R損傷的發生。目前，mKATP和mPTP作為心肌I/R損傷線粒體保護途徑的重要靶點已被廣泛研究，并顯示良好的心肌保護作用。線粒體RIRR途徑產生的ROS、膜通透性的改變以及線粒體形態的改變是近年來發現的參與心肌I/ R損傷的重要機制，抑制或減小這些改變均能改善心肌I/R損傷。隨著研究的深入和I/R損傷線粒體機制的進一步闡明，直接或間接保護線粒體完整性，維持和控制線粒體穩態平衡，增強線粒體的缺血耐受性必將成為防治心肌I/R損傷的重要策略。

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