兔病毒性出血癥病毒的分離與鑒定

馬 越

（甘肅省玉門市畜牧獸醫(yī)局，玉門 735211）

兔瘟又稱兔病毒性出血癥（RHD），是兔的一種以全身性出血和多發(fā)性血管內(nèi)凝血為主要癥狀的急性、敗血性、病毒性傳染病。可通過呼吸道、消化道、皮膚等多種途徑傳染，潛伏期48～72 h。RHDV屬杯狀病毒科兔病毒屬，其核衣殼僅有一種相對分子質(zhì)量60 000的主要結(jié)構(gòu)蛋白（Vp60）組成。病毒粒子在電鏡下呈球形，20面體對稱結(jié)構(gòu)。能凝集人的O型紅血球，對綿羊紅血球有輕度凝集，不凝集其他動物的紅血球[2]。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病毒

兔病毒性出血癥病毒（RHDV），由甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)預(yù)防組提供。

1.1.2 試驗動物

試驗兔為甘肅省蘭州市安寧區(qū)某農(nóng)戶家自養(yǎng)家兔，2個半月齡，未接種過疫苗，也未接觸過感染源。

1.1.3 設(shè)備與試劑

離心機、混勻機、電鏡、試管、燒杯、離心管、剪毛剪、5 ml注射器、手術(shù)刀、剪刀、滅菌棉、無菌手套、紗布、濾紙、鑷子、照相機。生理鹽水、雙抗、PEG6000、NaCl、氯仿、PBS液。

1.2 方法

1.2.1 病料處理

將實驗室病毒反復(fù)凍融3次，取2 ml裝于離心管，標(biāo)記為1號病毒，用于感染1號兔；然后再取8 ml組織研磨液4 ℃ 5 000 r/min 30 min，取上清2 ml，標(biāo)記為2號病毒，用于感染2號兔。

1.2.2 動物接種

將2管RHDV分別接種2只敏感健康兔（2個半月齡家兔，未免疫，也未接觸過病原），然后觀察其臨床癥狀及發(fā)病特征。

1.2.3 提取處理

1號兔于28 h左右死亡，2號兔約65 h左右死亡。將病死兔在實驗室剖檢，摘取有典型病變的內(nèi)臟及器官，包括肝組織、脾組織、氣管、肺組織、腎組織、心臟，然后加無菌生理鹽水20 m1，研磨均勻后加入適量“雙抗”，置4 ℃冰箱過夜，置-30 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 病毒提純

1.2.4 .1 取病死兔的保存組織研磨液，以0.005M PBS液（含0.15M NaCI，pH7.4）制成1：10（W：V）的懸液，-20 ℃凍融3次。

1.2.4 .2 取適量病料，用4層紗布過濾，去除大雜質(zhì)及組織，收集濾液。

1.2.4 .3 將濾液用濾紙再次過濾，再次收集濾液。

1.2.4 .4 將濾液1 000 rpm 離心30 min去除組織雜蛋白，收集離心上清液。

1.2.4 .5 在上清液中加入1/10體積的氯仿置于混勻機上混勻，然后放入4 ℃冰箱，作用30 min。

1.2.4 .6 將混勻液體5 000 rpm離心30 min，收集上層水相液，加入PEG6000及NaCl至終濃度6%和3%，振搖、使充分混合溶解，放置于4 ℃冰箱過夜。

1.2.4 .7 將過夜后的病毒液1O OOO rpm離心，30 min后棄上清。

1.2.4 .8 沉淀用適量的0.005M PBS液懸浮，加入1/10體積的氯仿置于混勻機上混勻，然后放入4 ℃冰箱，作用30 min。

1.2.4 .9 將混勻液體5 000 rpm離心30 min，收集上層水相液，即為提純病毒液，-20℃凍存。

2 結(jié)果

2.1 臨床癥狀

1號兔發(fā)病時，精神沉郁，完全拒食，不愿走動，并伴有全身抽搐癥狀，鼻孔冒出血性氣泡。

2號兔發(fā)病時，采食減少甚至廢絕，精神不振，被毛粗亂，迅速消瘦，結(jié)膜潮紅，觸摸耳部，有明顯的發(fā)熱現(xiàn)象，并伴有神經(jīng)癥狀，尖叫抽搐而死，鼻孔有鮮血樣泡沫流出。

2.2 剖檢

發(fā)病兔鼻孔流出泡沫狀的血液，肛門松弛，有少量淡黃色的粘性稀便，病死兔出現(xiàn)全身敗血癥變化，尸僵通常完好，但血液凝固不良。眼結(jié)膜充血，顏色紫紅。2側(cè)鼻孔有血性氣泡或鮮血流出。口咽粘膜充血出血，氣管粘膜充血潮紅，且有出血點與出血斑，血液凝固不良。兩側(cè)肺臟膨大，顏色暗紅，肺膜下有出血點或出血斑。肺切面暗紅、濕潤，稍壓擠時有多量的血性液體流出。各肺葉均有廣泛的出血點、出血斑或大片出血區(qū)域。

3 討論與小結(jié)

3.1 發(fā)病情況分析

實驗前，對實驗室病毒未進(jìn)行傳代培養(yǎng)時，首次被感染兔未發(fā)病，其原因可能是被感染兔為市場出售的肉兔，接種了兔瘟疫苗，對病毒具有了較強的抵抗力；其次實驗室病毒存放時間過長，毒力減弱，未能在兔體內(nèi)大量增殖。但二次試驗中，被感染兔分別在28 h左右和65 h左右發(fā)病死亡，而且病變特征明顯，這是由于二次試驗兔來自周邊農(nóng)戶家，據(jù)了解未曾注射過兔瘟疫苗，也未接觸過該病原，并且所感染的病毒為最近傳代培養(yǎng)后提取的，毒力增強所致。

3.2 病毒提純分析

有一部分離心管內(nèi)的提純病毒液顏色呈淡紅色，可能是由于在提取過程中，有部分紅細(xì)胞等雜質(zhì)未能相對徹底的去除干凈，但大部分病毒液顏色正常，為無色液體。

3.3 電鏡觀察分析

提純后的病毒在電鏡下觀察時模糊不清，可能是由于未能將雜質(zhì)相對徹底的去除所致。除此之外，試驗過程中有些試驗步驟受時間及條件限制未能連續(xù)進(jìn)行，可能對試驗結(jié)果也產(chǎn)生了一定影響。如果能將病毒進(jìn)一步進(jìn)行純化，其效果可能會比較好。

[1]徐為燕.兔病毒性出血癥研究進(jìn)展及其在國際上的評價[J].南京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，1994，24：7～9

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[3]王俊東，劉宗平.收益臨床診斷學(xué)[M].北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2009

[4]陳玉漢.兔的一種病毒性新病——兔瘟[J].廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)，1987，6，28～31

[5]陳溥言主編.獸醫(yī)傳染病學(xué)[M].北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2006

[6]陳杖榴主編.獸醫(yī)藥理學(xué)[M].北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2001

[7]陳繩亮，趙林.兔出血癥病毒兩種提純方法的比較研究[J].湖北農(nóng)業(yè)科技，1992，44（11）：17～19

[8]吳繼陽，趙曉彤，呂化廣.兔病毒性出血癥人工感染病例臨床及病理學(xué)觀察[J].遼寧畜牧獸醫(yī)，1999，22（6）：66～70