生物傳感器在真菌毒素檢測中的應用

孫永明 陳建紅 錢跟林 楊敦祥 陸 瑾

（1.江蘇省吳江市畜牧獸醫站，吳江 215200；2.南京農業大學，南京 210095）

生物傳感器是將生物技術和電子技術相結合，以生物學組件作為主要功能性元件，能夠感受規定的被檢測物質的量，并按照一定規律將其轉換成可識別信號的器件或裝置。它一般由生物識別元件、轉換元件、機械元件和電氣元件所組成[1]。生物傳感器根據分子識別元件與待測物結合的性質可分為：（1）利用酶的專一性和催化性的催化型生物傳感器（酶傳感器和微生物傳感器等）；（2）利用分子間特異親和性的親和型生物傳感器（免疫傳感器和DNA傳感器等）。利用換能器的性質，可將生物傳感器分為：電化學生物傳感器、壓電晶體生物傳感器和光纖生物感器等[2]。其中，上述許多產品具有實用開發價值。

毒素（toxin）是由生物體產生的，其極少量即可引起動物中毒。按來源可分為動物毒素、植物毒素和微生物毒素。其中，微生物毒素包括真菌毒素和單細胞藻類（如原核的藍藻和真核的甲藻）毒素等[3]。毒素對食品生產各個環節的危害性很大，2011年我國發生的黃曲霉毒素污染食用油和牛奶的事件在全國引起了很大反響。因此，加強對其檢測至關重要。本文就生物傳感器在幾種常見真菌毒素的檢測中的應用狀況及應用前景進行概述。

1 生物傳感器的研究現狀

目前，生物傳感器應用較多的領域是在醫療、醫藥、生物工程、環境保護、食品、農業、畜牧等與生命科學關系密切的一些領域。例如，臨床上用免疫傳感器等生物傳感器來檢測體液中的各種化學成分，為醫生的診斷提供依據；生物工程產業中用生物傳感器監測生物反應器內各種物理、化學、生物的參數變化以便加以控制；環境監測中用生物傳感器監測大氣和水中各種污染物質含量，食品行業中用生物傳感器檢測食品中營養成分和有害成分的含量、食品的新鮮程度等[4]。

早在1979年，Matssunage等開發了非染料偶合的燃料電池型微生物電極系統，檢測范圍107～109cfu/ml。1982年，Nishikawa等以2，6-二氯酚靛酚為媒介，并用濾膜預富集制成的生物傳感器對細菌的檢測極限可達104cfu/ml。1989年，Muramatsu等用一個壓電晶體傳感器系統測定病原微生物（Canolidaalbicans），測定范圍106～108cfu/ml。Cao等在1995年應用光纖傳感器檢測分析血清、全血、血漿中的鼠疫耶爾森氏菌F1抗原；Rowe-Taitt等在2 000年使用光纖傳感器檢測了炭疽桿菌、土拉弗氏菌等；Anderson等應用光纖傳感器RAPTOR，先后檢測了鼠疫桿菌F1抗原、葡萄球菌腸毒素、蓖麻毒素、炭疽芽孢、土拉弗氏菌等[2-3]。2004年在西班牙格拉納達會展中心召開的第八屆世界生物傳感器大會對9個專題進行了分組討論。包括核酸傳感器和DNA芯片、免疫傳感器、酶傳感器、組織和全細胞傳感器、用于生物傳感器的天然與合成受體、新的信號轉導技術、系統整合/蛋白質組學/單細胞分析、生物電化學/生物燃料/微分析系統、商業發展和市場[5-7]。其中，單分子/細胞分析和生物印跡生物傳感器由于它們良好的發展態勢及在生命科學研究中的重要位置成為與會學者討論的熱點問題[8-10]。

2 生物傳感器在真菌毒素檢測中的應用

真菌毒素是真菌分泌產生的有毒代謝產物。常見污染食品的真菌毒素主要有黃曲霉毒素、赭毒素、雜色曲霉素、T-2毒素、伏馬素、鐮刀菌稀醇類毒素、展青霉素和橘霉素等。檢測食品中污染真菌毒素的方法主要有薄層層析法和液相色譜法等[11]。近20多年來，醫學方法在真菌毒素的檢測中得到了較好的應用，以此為基礎的免疫生物傳感器快速檢測真菌毒素的方法也有研究報道和應用，其中以免疫傳感器用于檢測黃曲霉毒素B1和伏馬素B1的研究報道為最多[12]。此外，也有運用微生物傳感器和以纖毛蟲微生物敏感材料的傳感器檢測展青霉素、黃曲霉毒素B1和T-2毒素的研究報道[13]。

2.1 黃曲霉毒素B1

黃曲霉毒素B1（AflatoxinB1，AFB1）是目前所發現的毒性最強的真菌毒素，能引起人類（尤其是兒童）以及各種動物的急性中毒和死亡，被國際癌癥研究中心（ICRC）定為是人類的致癌劑。通過光纖免疫傳感器來測定花生和玉米抽提物，可測得0.05ng/ml的AFB1

[14-15]。Stracha等人用一種傳感器來檢測食物中的AFB1，靈敏度也很高，可達4ng/ml，分析時間只用了8min，而且特異性強[16]。Carter等人利用光纖免疫傳感器來測定花生和玉米抽提物中的AFB1，檢測限可達0.05ng/ml[17]。

2.2 雜色曲霉素

雜色曲霉素（Sterigm atocystin，ST），是黃曲霉毒素合成途徑的前體（sterigm atocystin（ST）-O-m ethylsterigm atocystin（OM ST）-AFB1）。但雜色曲霉素由于污染含量高，危害性高于黃曲霉毒素[42]。

將黃曲霉毒素氧化酶（AFO）固定在殼聚糖（CS）-單壁碳納米管（SWCNTs）雜交膜中，組裝在聚鄰苯二胺（POPD）修飾的金電極（Au）表面，制備了對雜色曲霉素（ST）敏感的生物傳感器（AFO/CS-SWCNTs/POPD/Au）。運用原子力顯微鏡（AFM）、傅立葉變換紅外光譜（FT-IR）和交流阻抗技術（EIS）對電極組裝過程進行了表征。循環伏安法研究表明，AFO在修飾電極上發生了準可逆的氧化還原反應，是表面控制過程，其式量電位為0.436 V（vs.Ag/AgCl），說明包埋在CS-SWCNTs中的AFO和電極之間發生了直接電子傳遞。AFO修飾電極對ST具有明顯的電催化作用，其表觀米氏常數appMK為7.13μmol/ml，催化電流與ST濃度在10～310 ng/ml范圍內呈線性關系，相關系數為0.997，檢出限為3 ng/ml（S/N=3），響應時間小于10s。組裝的生物傳感器具有較好的穩定性與重現性，連續檢測20 ng/ml的ST標準溶液11次，電流值RSD為3.9%；放置1個月后，其電流響應值仍為初始值的85.6%[19-20]。

該方法具有較高的選擇性和靈敏度，應用于實際樣品檢測時，其回收率在87.6%～105.5%之間[19-20]。建立的ST含量的電化學測定方法簡便快捷，測定結果令人滿意。

2.3 伏馬菌素B1

伏馬菌素B1（Fum onisinsB1，FB1）是天然污染玉米食品和飼料的主要毒素組分，與馬腦白質軟化癥、豬的肺水腫癥和人類食道癌等人、畜疾病有關。Wayne等人[21]用表面等離子體振子共振免疫傳感器來檢測玉米抽提物中的FB1濃度，可達到檢測下限為50ng/ml，分析時間為10min；Thamlpson[22]等人用光纖免疫傳感器來檢測FB1，可測得下限為10ng/ml，響應時間提高到4min。微生物傳感器[23]對幾種突變物AF-2、絲裂霉素、克菌丹、黃曲霉素B1、硝基胍的檢出限分別為1.6，0.5，0.9，0.8μg/m L，比采用Am es等方法不僅時間短（前者60min，后者少則2-3d，長則7d），靈敏度也高（前者對AF-2的最低限為1.6μg/ml，后者為10μg/ml）。

該傳感器工作菌株為枯草桿菌，已知該菌株野生型（Rec+）的DNA在受到化學損傷后能通過分子重組而得到修復，故能繼續繁殖；而喪失這種自我修復能力的缺陷型菌（Rec-）在DNA受到化學損傷后，因失去繁殖能力而死亡。將Rec+和Rec-菌株分別固定在一對氧電極表面，即構成致突變傳感器[24]。

3 生物傳感器的應用前景

生物傳感器的問世極大地簡化了微生物毒素的分析方法，不僅減少了分析時間，提高了靈敏度，使測定過程變得更為簡單，而且便于實現自動化，使微生物毒素的現場檢測成為可能。盡管現在生物傳感器的應用受到其穩定性、重現性和使用壽命等諸多限制，再加上待測物成分多且含量差異大、抗體種類少和不穩定等問題，許多生物傳感器的研究還處在實驗階段，實際應用時環境和樣品的復雜性成為制造此類傳感器的主要障礙，限制了實現商業化的生物傳感器的數量。但是，由于生物傳感器具有高選擇性、響應快，操作簡單、攜帶方便和適合于現場檢測等優點，所以仍是目前重點研究的對象。

對生物傳感器檢測微生物毒素的研究是各國科學家積極探索的課題，這些制約條件也是各國科學家致力于解決的問題。隨著計算機技術、材料技術、生物技術等的發展，生物傳感器現存的諸多不足將有望得到完善，在微生物毒素檢測中的應用將越來越廣泛，并且在現場檢測方面無疑將會發揮更大的作用。生物傳感器在微生物毒素檢測中的發展方向，主要是進一步拓寬應用范圍；由單一功能向多功能發展；與其他儀器集成，以提高靈敏度和分析速度，實現準確、快速檢測；向便攜式，操作簡便、低成本，商業化、產業化方向發展。

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