aid A－aah基因及其編碼的糖基化黏附素AIDA－I的研究進展

張 靜，姜中其

擴散粘附性大腸桿菌（DAEC）對小腸粘膜的粘附是腹瀉發病中重要的一步。1988年從兒童腹瀉分離的DAEC能介導一種特殊的粘附—彌散型粘附［5］，介導這種粘附的蛋白被命名為 AIDA－I（adhesin involved in diff use adherence）。隨后研究發現AIDA－I不僅僅存在于人源致腹瀉大腸桿菌中，豬源大腸桿菌中也有分布。AIDA－I是一種多功能蛋白，能介導細菌粘附上皮細胞、細菌的自動凝集以及細菌生物膜的形成。AIDA－I在結構上屬于自主轉運蛋白，不需要其他分子的幫助就能轉運到細胞外，其轉運機制的研究對優化其他蛋白的分泌具有重要作用。aid A－aah基因及其編碼的糖基化黏附素的研究從分子水平上揭示了病原菌黏附素與宿主細胞受體的相互作用和致病機制，對于控制疾病流行有重要意義；同時黏附素轉運機制的研究對其他蛋白的分泌優化表達也有重要作用。

1 黏附素AIDA－I的轉運過程

黏附素AIDA－I屬于自主轉運蛋白，是TYPE Va途徑［1］組成革蘭氏陰性菌蛋白分泌的主要方式。AIDA－I黏附素是132 KDa的蛋白原的前體形式［2］，N端和C端都要加工后才能有活性［3］。轉運過程一般分為3步［4］：1．蛋白原的前體形式從內膜穿出，從其他自主轉運蛋白轉運方式推測可能是sec分泌途徑。在這個過程中，N端的49個氨基酸組成的信號肽被切割，剩余的AIDA－I被釋放到細胞周質中［5］；2．穿過外膜時，位于N端的14個二級結構β－轉角在細胞外膜內形成超二級結構β－桶型結構，相當于在外膜內行成“孔”，這個結構類似于膜內蛋白，被稱為β2，另外2個β－轉角位于細胞膜上，這16β結構被稱為AIDA C［6］；3．成熟的 AIDA－I通過AIDAC結構穿過外膜。AIDA－I在穿過細胞膜后被切割成2部分：45 k Da的AIDAc和100 k Da成熟的黏附素AIDA－I，后者以非共價鍵的形式與細胞膜相連，屬于鞭毛結構。但這個切割過程對黏附素AIDA－I功能的發揮不是必需的［7］。溫和加熱可以使黏附素AIDA－I從細胞膜上分離，整個分泌過程不需要其他蛋白或分子的幫助。

研究人員對AIDA－I的轉運過程提出過3種模型。模型一：發夾模型，是由Pohlner等提出的［8］，適用于大多數自主轉運蛋白。但“發夾模型”受到了大腸桿菌淋球菌免疫球蛋白 A1（Ig A1）－蛋白酶轉位分子的挑戰。模型二：是由Veiga等提出“六聚物模型”［9］。適用于6個g A1－蛋白酶單體形成一個微孔使α結構穿過，這個模型對理解自主轉運蛋白有所幫助。模型三：由Oo men等人提出［11］。認為外膜蛋白Omp85可能參與了折疊蛋白的轉導，甚至可能有利于自主轉運蛋白的折疊的完成［10］。Omp85已經證實能夠幫助和保護自主轉運蛋白β－桶形結構插入外膜中，提供微孔使黏附素通過。

2 aid A－aah基因結構及其同源性的比較

aid A和aah基因是位于大腸桿菌的一個6 kbp的大質粒上，兩者共同編碼糖基化黏附素AIDA－I，也被稱之為糖基化島，是一個毒力島［12］。aid A基因是編碼黏附素的主要基因，而位于aid A基因上游的aah基因是AIDA－I的修飾基因，aah基因編碼的是糖基轉移酶（autotransporter adhesion heptosyltransferase，AAH）。AAH能使18個庚糖轉移到1個ADIA－I上，最終形成成熟的100 KDa的糖基化蛋白AIDA－I［13］。以庚糖形式的糖基化蛋白在原核生物上是首次發現［14］。

不同來源致病菌aid A－aah基因及其表達的AIDA－I蛋白有一定的序列保守型和多樣性。分析致仔豬腹瀉大腸桿菌分離株aid A基因核苷酸序列表明開放性閱讀框（ORF）為3 864 bp，而人源致腹瀉大腸桿菌2 787菌株aid A的長度為3 861 bp，其同源性96．5%。但其轉運蛋白部分的核苷酸序列的同源性為98．9%。兩類致病菌的aah基因核苷酸系列都是1 176 bp的ORF，同源性為99．8%，氨基酸同源性為99．5%［15］。

3 糖基化黏附素AIDA－I表達的調控

編碼糖基化黏附素AIDA－I的aid A－aah基因是以雙順反子形式轉錄和表達的，啟動子有2個，分別是位于aah上游149和128核苷酸處［16］。另外aid A基因又有本身的啟動子啟動轉錄和表達［17］。其轉錄和表達水平受不同菌株和不同生長環境的影響。在營養缺乏，如高細胞密度下能夠獲得最大程度的表達。在hns和rf a H缺失菌中aid A－aah基因轉錄水平得到加強，另外，在不同大腸桿菌K－12菌株中轉錄水平不同。

4 黏附素AIDA－I的受體

研究發現AIDA－I能夠介導細菌結合多種類型的哺乳動物細胞，如Hela細胞、HT29人的克隆癌細胞、猴成纖維細胞和中國倉鼠卵巢細胞等，表明其受體分布廣泛性和多樣性。AIDA－I在He La細胞上的結合蛋白是分子量為119 k Da N－端糖基化膜蛋白（gp119），PI大約為5．2［18］。有學者認為豬小腸黏膜上皮細胞上的受體可能是Ig G Fc的結合蛋白［19］。

5 aid A基因和編碼的黏附素AIDA－I在細菌致病中的作用

黏附素AIDA－I是致人和豬腹瀉大腸桿菌的毒力因子，在腹瀉發病過程中具有重要的作用。AIDA－I能粘附上皮細胞、介導細菌的自動凝集和誘導生物膜的形成，是一種重要的多功能蛋白。細菌的自動凝集是通過AIDA－I高度特異性的相互作用形成的，膽酸鹽和去氧膽酸鈉能夠破壞AIDA－AIDA相互作用，從而阻止細菌通過群體和單細胞形式轉變而完成的感染［20］。AIDA－I能夠顯著加強細菌生物膜的形成，這種細菌生物膜的平均厚度能夠達到40μm［21］。AIDA介導的細胞的聚集需要細胞之間很近的接觸，F1菌毛（長度約1μm）能夠屏蔽和阻止形成AIDA介導的細胞聚集所必需的細胞之間近距離接觸，但是F1存在并不影響AIDA的表達和轉運。

2003年Ngeleka等［19］發現從腹瀉仔豬分離的大腸桿菌有20．5%是 AIDA－I／STb型［22］。2007年Ravi等發現豬源致腹瀉大腸桿菌臨床分離株PD20（AIDA－I＋、STb＋）經過16～18 h孵育能導致腹瀉，而對照株 PD20 M（AIDA－I－、STb＋）不能致瀉。同時還發現AIDA－I＋大腸桿菌能夠介導細菌的自動凝集并能促進細菌生物膜的形成。不同菌株雖然都能表達AIDA－I，但由于致病型不同，它們引起腹瀉的機制并不相同。［23］

6 總結和展望

目前已公認，aid A－aah基因編碼的黏附素AIDA－I是致腹瀉大腸桿菌確定的毒力因子，能介導細菌對上皮細胞粘附、侵襲、細菌的自動聚集和生物膜的形成，在腹瀉的發生發展中均具有重要的作用。然而，關于該基因的表達調控、免疫學及致病機理等方面尚未完全闡明。AIDAc轉運蛋白在優化其他蛋白的分泌表達以及AIDA－I作為疫苗阻斷大腸桿菌作用上皮細胞的研究均具有重要意義。

［1］Henderson IR，Navarr o－Garcia F，Desvaux M，etal．Type V pr otein secretion pat h way：the autotransporter story［J］．Microbiol Mol Biol R，2004，68（4）：692－744．DOI：10．1128／MMBR．68．4．692－744．2004

［2］Char bonneau ME，Mourez M．Functional organization of the autotransporter adhesin involved in diff use adherence［J］．J Bacteriol，2007，189（24）：9020－9029．DOI：10．1128／JB．01238－07

［3］Maurer J，Jose J，Meyer T．Charaterization of the essential transport f unction of the AIDA－I and evidence supporting structual predictions［J］．J Bacteriol，1999，181（22）：7014－7020．

［4］Muller D，Benz I，Tapadar D，etal．Arrangement of the translocator of the autotransporter adhesin involved in diff use adherence on the bacterial surface［J］．Infect Immun，2005，73（7）：3851－3859．DOI：10．1128／IAI．73．7．3851－3859．2005

［5］Benz I，Sch midt MA．AIDA－I，the adhesin involved in diff use adherence of the diarr hoeagenic Escherichia coli strain 2787（O126：H27），is synthesized via a precursor molecule［J］．Mol Microbiol，1992，6（11）：1539－1546．DOI：10．1111／j．1365－2958．1992．tb00875．x

［6］Konieczny MP，Benz I，Hollinderb?u mer B，etal．Modular organization of the AIDA autotransporter translocator：The N－terminalβ1－do main is surface－exposed and stabilizes the transmembraneβ2－domain［J］．Anton Leeuw Int J，2001，80：19－34．DOI：10．1023／A：1012084325728

［7］Charbonneau ME，Berthiaume F，Mourez M．Proteolytic processing is not essential for multiple f unctions of the Escherichia coli autotransporter adhesin involved in diff use adherence （AIDA－I）［J］．J Bacteriol，2006，188（24）：8504－8512．DOI：10．1128／JB．00864－06

［8］Pohlner J，Halter R，Beyreuther K，etal．Gene structure and extrecellular secretion of Neisseria gonorrhoeae Ig A protease［J］．Nature，1987，325（29）：458－462．DOI：10．1038／325458a0

［9］Veiga E，Sugawara E，Nikaido H，etal．Export of aut otransported proteins proceeds t hr ough an oligo meric ring shaped by C－ter minal do mains［J］．Embo J，2002，21（9）：2122－2131．DOI：10．1093／emboj／21．9．2122

［10］Oo men CJ，Ulsen PV，Gelder PV，etal．Str ucture of the translocat or do main of a bacterial autotransporter［J］．Embo J，2004，23（6）：1257－1266．DOI：10．1038／sj．emboj．7600148

［11］Paschen SA，Waizenegger T，Stan T，etal．Evolutionary con－servation of biogenesis ofβ－barrel membrane proteins［J］．Nature，2003，426（6968）：857－862．DOI：10．1038／nature02208

［12］Her bert S，Michael H．Pat hogenicity islands in bacterial pat hogenesis［J］．Clin Micr obiol Rev，2004，17（1）：14－56．DOI：10．1128／CMR．17．1．14－56．2004

［13］Benz I，Sch midt MA．Glycosylation wit h hept ose residues mediated by the aah gene pr oduct is essential for adherence of the AIDA－I adhesin［J］．Mol Microbiol，2001，40（6）：1403－1413．DOI：10．1046／j．1365－2958．2001．02487．x

［14］Benz I，Sch midt MA．Never say never again：pr otein glycosylation in pat hogenic bacteria［J］．Mol Microbiol，2002，45（2）：267－276．DOI：10．1046／j．1365－2958．2002．03030．x

［15］Zhao LX，Chen X，Xu XJ，etal．Analysis of the AIDA－I gene sequence and prevalence in Escherichia coli isolates from pigs wit h post－weaning diarr hoea and oedema disease［J］．Vet J，2009，180（1）：124－129．DOI：10．1016／j．tvjl．2007．10．021

［16］Frederic B，Leblond MF，Harel J，etal．Gr owt h－phase－dependent expression of the operon coding for the glycosylated autotransporter adhesin AIDA－I of pat hogenic Escherichia coli［J］．Micr obiology，2010，311：176－184．DOI：10．1111／j．1574－6968．2010．02088．x

［17］Benz I，Alen TV，Bolte J，etal．Modulation of transcription and characterization of the pro moter organization of the autotransporter adhesin heptosyltransferase and the autotransporter adhesin AIDA－I［J］．Microbiology，2010，156（4）：1155－1166．DOI：10．1099／mic．0．032292－0

［18］Laar mann S，Sch midt MA．The Escherichia coli AIDA autotransporter adhesin recognizes an integral membrane glycoprotein as receptor［J］．Micr obiology，2003，149：1871－1882．DOI：10．1099／mic．0．26264－0

［19］Benz I，Sch midt MA．Isolation and ser ologic characterization of AIDA－I，the adhesin mediating the diff use adherence phenotype of the diarr hea－associated Escherichia coli strain 2787 （0126：H27）［J］．Infect Immun，1992，60（1）：13－18．

［20］Girard V，Cote JP，Char bonneau ME，etal．Confor mation change in a self－recognizing aut otransporter modulates bacterial cell－cell interaction［J］．J Biol Chem，2010，285（14）：10616－10626．DOI：10．1074／jbc．M109．069070

［21］Sherlock O，Schembri MA，Reisner A，etal．Novel roles for the AIDA adhesin from diarr heagenic Escherichia coli：cell aggregation and biofil m for mation［J］．J Bacteriol，2004，186（23）：8058－8065．DOI：10．1128／JB．186．23．8058－8065．2004

［22］Ravi M，Ngeleka M，Ki m SH，etal．Contribution of AIDA－I t o the pat hogenicit y of a porcine diarr heagenic Escherichia coli and to intestinal colonization t hrough biofil m for mation in pigs［J］．Vet Micr obiol，2007，120（3－4）：308－319．DOI：10．1016／j．vet mic．2006．10．035

［23］Pritchard J，Ngeleka M，Middleton DM．In vivo and in vitro colonization patterns of AIDA－I－positive Escherichia coli isolates from piglets with diarrhea［J］．J Vet Diagn Invest，2004，16：108－115．DOI：10．1177／104063870401600203