頂復門原蟲誘導宿主micro RNAs變化的研究進展

范藝凡，周東輝，徐民俊，李成琳，朱興全，蔣文燦

頂復門（Apicomplexan）寄生蟲包括多種專性寄生于細胞內的原蟲，有一些不僅嚴重危害人類和動物的健康，而且還給全球畜牧業造成巨大的經濟損失。其中，瘧原蟲（Pl asmodium）、隱孢子蟲（Cr y ptosporidiu m par vu m）、弓形蟲（Toxopl asma gondii）等危害比較嚴重［1］。為了保證在細胞內生存，頂復門原蟲能精確地識別有利于它們發育的宿主細胞，并向宿主細胞內分泌一些蛋白質，從而干擾宿主信號通路（例如細胞凋亡，細胞因子的產生），改變宿主的防御性能［2－4］。雖然已有研究證明頂復門原蟲能改變宿主細胞環境，但具體改變的分子機制仍然不清楚。最近，頂復門原蟲誘導宿主micro RNAs（mi RNAs）表達水平變化的發現也許將為研究寄生蟲如何改變宿主體內環境的分子機制提供新的線索［5－9］。

mi RNAs是一類長度約為22個核苷酸的內源性非編碼單鏈小分子RNA，它們通過與靶mRNAs的完全或不完全結合來降解或抑制靶m RNAs的翻譯，對動物和植物轉錄后基因的表達調控起著重要的作用［10］。mi RNAs約占人類總基因的0．5%～1．5%，卻調控大約30%的基因轉錄，mi RNAs的靶基因分布廣泛，每個成熟的mi RNA可以抑制幾十甚至數百個靶mRNAs的表達，調控細胞生長、凋亡、發育、代謝、基因轉錄、翻譯和免疫反應等［11－14］。

1 頂復門原蟲改變宿主體內環境

1．1 Toll－like受 體 與 免 疫 應 答 Toll－like受 體（TLRs）是一類識別病原微生物的重要蛋白質。通過對弓形蟲、伯氏瘧原蟲（Pl asmodiu m ber ghei）、克氏錐蟲（Tr y panosoma cr uzi）等的研究，發現 TLRs參與了宿主對入侵頂復門原蟲的識別［15－17］。弓形蟲感染宿主后，宿主通過依賴骨髓分化蛋白88（My D88）的 TLRs途徑促進IFN－r的產生，因此TLRs途 徑 對 宿 主 抵 抗 弓 形 蟲 感 染 很 重 要［18－19］。TLRs受體激活一系列轉換蛋白（例如 My D88）最終導致一系列包括核因子（NF－k B），Janus激酶（JAK）和信號轉導及轉錄激活因子（STAT）信號途徑的激活。信號途徑的激活促使一系列宿主細胞抗病原蛋白轉錄的激活，然后產生抗微生物分子（例如促炎細胞因子、趨化因子和IL－12），最終將增強非特異性免疫［20－22］。為了維持免疫應答平衡，上皮細胞對TLRs受體免疫信號通路進行了負饋調控。例如，細胞因子誘導的Src同源2蛋白（CIS）和細胞因子信號抑制物4（SOCS）將使致炎癥因子的產生得到明顯的抑制。最有代表性的SOCS家族成員是CIS和SOCSI－3蛋白質，它們通過干擾JAK／STAT信號途徑來抑制細胞因子的產生。因此，在感染頂復門原蟲的機體中，識別病原的TLRs受體能誘導CIS／SOCS的表達和調控細胞因子受體的信號通路［23－26］。

1．2 向宿主細胞內分泌蛋白質 當寄生蟲侵入宿主細胞后，會分泌一些能改變宿主細胞環境的效應分子，例如：弓形蟲利用棒狀體和致密顆粒分泌細胞器向宿主細胞注入一些有效因子。這些因子能幫助弓形蟲適應宿主細胞環境，其中包括：①有助于弓形蟲侵入宿主細胞的棒狀體蛋白ROP16，它磷酸化STAT3和STAT6，從而降低白介素（IL－6，IL－2）的產生［27－28］。②ROP18磷酸化宿主細胞免疫相關的GTP酶，干涉細胞抵抗外來微生物入侵的途徑［29－30］。③GRA15，它是一種致密顆粒蛋白，激活宿主轉錄因子NF－k B［31］。④還有一種進入宿主細胞核，但仍不清楚功能的蛋白磷酸化酶2C［32］。⑤UIS3是瘧原蟲在納蟲空泡膜內分泌的一種蛋白質，它結合肝臟脂肪酸結合蛋白（L－FABP）幫助瘧原蟲攝取宿主的脂肪酸［33］。⑥泰勒蟲分泌一些蛋白質同AT－hook DNA結合基序連接，它們從寄生蟲轉運到宿主細胞核從而改變宿主基因表達［34］。⑦弓形蟲分泌的親環蛋白－18（C－18）能刺激宿主通過TLRs受體通路產生IL－12［35］。因此，寄生蟲能分泌一些特異的效應分子調控宿主細胞轉錄因子（例如，STAT3和 NF－k B）。所以，有研究者推測這些寄生蟲分泌蛋白有助于改變宿主mi RNAs，從而重塑宿主體內環境。

2 頂復門原蟲改變宿主mi RNAs的表達

mi RNAs在哺乳動物體內的地位很重要，是免疫反應的重要調控因子。因此，一些mi RNAs參與特異性免疫和非特異性免疫（例如，炎癥細胞因子的產生，單核細胞和嗜中性粒細胞的增值，T細胞和B細胞的分化）。它們如同一道安全閥門抵抗外來基因在機體內表達，mi RNAs基因調控的失調將引發很多疾病（例如：癌癥）。哺乳動物細胞內的mi R－NAs通過與病毒（例如水泡性口炎病毒、泡沫病毒、艾滋病毒）直接結合而清除它們［36－38］。擬南芥的mi R－393通過抑制生長素信號途徑來抵抗細胞外病原假單胞菌的入侵，與此同時，細胞外病原假單胞菌也分泌一些蛋白質來抵抗小RNA介導的宿主免疫反應［39－40］。由于病毒，細菌能改變被感染機體 mi RNAs的表達量，一些研究者開始研究頂復門寄生蟲是否也通過影響宿主mi RNAs的表達量，最終誘導宿主細胞環境的改變。

2．1 弓形蟲 研究者發現弓形蟲感染宿主細胞后，將顯著改變宿主細胞mi RNAs表達。例如：Zeiner等發現人包皮成纖維細胞的mi R－17～92和mi R－106b～25隨著細胞感染弓形蟲后表達量將大量增加。然而，當人包皮成纖維細胞感染犬新孢子蟲（Neospor a caninu m）后，mi R－17 家 族 mi RNAs的表達量卻沒有改變。不同的頂復門原蟲對宿主細胞mi R－17家族mi RNAs表達量的不同影響，表明不同的頂復門原蟲能夠用自己獨特的方式改變宿主一些mi RNAs的表達［9］。后來Zeiner等又用一系列引物延伸實驗進一步證明了人包皮成纖維細胞在感染弓形蟲后，mi R－17家族 mi RNAs將顯著增加［41］。另外，已有研究表明，mi R－17～92能誘導髓樣細胞增殖和分化，從而參與機體抵御病原體早期免疫應答反應的調節［42］。由此可見，弓形蟲在感染宿主后，能引起宿主某些mi RNAs表達的改變，從而引起宿主的急性免疫應答反應。

2．2 隱孢子蟲 Let－7家族mi RNAs能在人類膽管上皮細胞內表達，感染了隱孢子蟲的人類膽管上皮細胞將導致pri－Let－7i和成熟Let－7表達量的降低，Let－7表達量的降低伴隨TLR4表達量的上調。在感染了隱孢子蟲的細胞中，Let－7與TLR4蛋白質表達量呈負相關的變化說明了mi RNAs介導的轉錄后調控途徑對頂復門原蟲感染的宿主細胞的基因調控很重要［5］。也有研究者發現，隱孢子蟲感染宿主后，將降低宿主 mi R－98和let－7的表達量，mi R－98或let－7與SOCS4的3末端非翻譯區結合將抑制SOCS4的翻譯，最終促進細胞因子誘導的Src同源2蛋白（CIS）和細胞因子信號抑制物4（SOCS）的表達。CIS和SOCS蛋白質通過干擾JAK／STAT信號途徑來抑制細胞因子的產生［8］。以上數據充分表明宿主在感染隱孢子蟲后，會顯著改變與調控TLR信號途徑相關mi RNAs的表達量。這表明，依賴mi RNAs為基礎的調控途徑將有助于宿主防御反應的產生。另外，隱孢子蟲還能降低膽管上皮細胞mi R－513表達水平，而且mi R－513能調控B7－H1蛋白［7］。

2．3 瘧原蟲 感染了夏氏瘧原蟲（Pl asmodiu m chabaudi mal aria）的肝臟細胞，將促進編碼IL－1β，TNF－α，IFN－γ，NF－κ和i NOS蛋白的 m RNAs表達，而這些因子涉及天然免疫，并且調控宿主感染病原后的免疫反應；同時降低CYP7 A1和SULT2 A2蛋白m RNA的表達，而這兩個蛋白與肝臟新陳代謝有關。另外，肝臟細胞的 mi R－26b，MCMV－mi RM23－1－5p，mi R－1274a表達量增加的同時降低了mi R－101b，let－7a，let－7g，mi R－193a－3p，mi R－192，mi R－142－5p，mi R－465d，mi R－677，mi R－98，mi R－694，mi R－374＊，mi R－450b－5p，mi R－464，mi R－377，mi R－20a＊ 和 mi R－466d－3p的表達量［43］。然而感染了瘧原蟲的肝臟，卻沒引起mi R－21的表達變化，而有研究者發現這個mi RNA涉及肝細胞的分化［44］。這些免疫因子和mi RNAs的動態變化證明宿主保護性免疫反應的產生結合了不同種類mi RNAs表達的重塑。岡比亞按蚊（Anopheles ga mbiae）感 染 瘧 原 蟲 后，Aga－mi R－34，aga－mi R－1174和 aga－mi R－1175表達量將降低，然而 agami R－989的表達量卻顯著升高。阻斷Dicer1和Ago1的mRNAs表達后將加強瘧原蟲感染岡比亞按蚊，說明這些mi RNAs調控岡比亞按蚊的免疫應答［45］。由于隱孢子蟲和瘧原蟲感染不同種類的宿主或宿主細胞后，都將降低let－7家族mi RNAs的表達量，表明let－7在宿主感染寄生蟲后起重要作用。

3 展 望

隨著mi RNAs相關技術的日趨成熟，關于頂復門原蟲誘導宿主mi RNAs表達變化的研究將會越來越多。然而，一個關鍵性問題有待解決：頂復門原蟲感染宿主后，宿主mi RNAs的重塑是因為原蟲干擾了宿主mi RNAs通路，還是宿主對病原的一個普遍免疫應答反應？事實上，犬新孢子蟲和弓形蟲對宿主細胞mi R－17家族mi RNAs表達量的差異性影響［9］，表明頂復門原蟲對宿主mi RNAs的改變不只是由宿主的免疫應答反應引起。這些獨特的方式會是像病毒一樣通過自己的脫氧核苷酸改變宿主mi RNAs嗎［46］？有研究者推測弓形蟲通過分泌自己的mi RNAs來擊破宿主細胞mi RNAs防御途徑。弓形蟲能產生一系列包括mi RNAs在內的內源性小RNA，然而一些原蟲卻沒有mi RNA調控機制，例如：隱孢子蟲、瘧原蟲［47］。那么，不能產生mi RNAs的頂復門原蟲又是怎樣改變宿主mi RNAs的呢？也許，頂復門原蟲通過分泌到宿主細胞的蛋白質來改變宿主mi RNAs。當然，宿主mi RNAs的改變也可能由依賴識別病原的TLRs受體通路引起的。宿主外在的病原影響因子和自身的免疫應答都可能改變宿主mi RNAs表達，從而重塑體內環境。進一步研究頂復門原蟲分泌到宿主細胞的蛋白質和宿主mi RNAs之間的關系，或許將拓寬我們對頂復門原蟲與宿主相互影響分子機制的認識。

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