高通量基因檢測系統MammaPrint與乳腺癌預后預測

王波 綜述 李洪勝 審校

廣州醫學院附屬腫瘤醫院乳腺腫瘤外科，廣東 廣州 510095

乳腺癌是高度異質性疾病，臨床分期及病理分級相同的患者對治療的反應和預后大不相同。如何準確預測患者復發風險及對治療的反應，采取適當的治療措施，從而避免治療不足或治療過度，是臨床醫師尤為關心的重要課題。隨著現代分子生物學及基因組學研究不斷深入，越來越多的研究結果證實：盡管乳腺癌是“一種”疾病，但實際上是許多細胞、組織功能異常的總和。與傳統的TNM分期、臨床病理指標相比，基因水平的多基因檢測系統能提供更準確的預后預測信息，用于指導個體化治療，合理利用有限醫療資源。在目前眾多的多基因檢測系統中，MammaPrint是首個經FDA批準用于臨床的多基因檢測系統。

1 MammaPrint 介紹

MammaPrint是2002年由荷蘭癌癥研究院開發的一種乳腺癌多基因檢測系統［1］。其運用cDNA微陣列技術，檢測78例臨床Ⅰ期或Ⅱ期的乳腺癌患者(淋巴結陰性，年齡<55歲，腫瘤直徑<5 cm)新鮮冰凍組織的RNA。所有患者至少隨訪5年，運用系統聚類統計方法，從25 000個候選基因中，篩選出與預后最相關的70個基因，組成MammaPrint檢測系統。根據基因表達與臨床結果的相關性，將患者分為預后良好組及預后不良組。預后良好組44例患者中位隨訪7.8年，無一例復發轉移；預后不良組34例患者5年內均出現了復發轉移。研究者將預后良好組作為參照，計算患者MammaPrint檢測的基因表達譜與預后良好組的Pearson相關系數，相關系數>0.4為低危組，≤0.4為高危組，其誤判率<10%。

2 有關MammaPrint 的回顧性臨床研究

2.1 MammaPrint對淋巴結陰性患者預后預測

高通量基因檢測系統MammaPrint建立后，不少研究者對其不斷加以驗證， Buyse等［2］對307例來自歐洲5個中心的腋窩淋巴結陰性患者進行獨立樣本的MammaPrint檢測和臨床病理指標分析，中位隨訪13.6年，終點事件為遠處轉移時間、無病生存和總生存。研究結果顯示，MammaPrint對于各終點事件的預測要優于臨床病理指標，其中對于遠處轉移時間和總生存的預測優勢更明顯，風險比(HR)分別為2.32和2.79。由于腋窩淋巴結狀態是臨床治療及預后判斷的重要指標之一，MammaPrint能較為準確判斷腋窩淋巴結陰性患者的預后，因而再次驗證了MammaPrint對于腋窩淋巴結陰性患者預后預測的準確性和其他臨床病理指標所不具備的優越性。

2.2 MammaPrint對淋巴結陽性患者預后預測

腋窩淋巴結陽性的乳腺癌患者，傳統的臨床病理指標評價意味著預后不良，按照現時的臨床治療方案絕大多數會給予系統化療。然而Joensuu等［3］發現，部分腋窩淋巴結陽性患者，單行合理的局部治療也能長期無轉移生存。那么，基于腋窩淋巴結陰性患者建立的MammaPrint檢測系統可否較準確劃分這兩類患者，Mook等［4］對241例淋巴結1～3枚臨床分期Ⅰ～Ⅲ期的可手術乳腺癌患者冰凍標本進行MammaPrint檢測，99例(41%)患者被評為低危組，142例(59%)患者被評為高危組。結果顯示：低危組和高危組的10年無轉移生存率和乳腺癌特異性生存率分別為91%、96%和74%、74%。與Adjuvant！Online系統預測的結果比較顯示：87%的患者被Adjuvant！Online系統預測為預后不良。而在這87%的患者中，MammaPrint系統評價其中的34%患者預后良好，其10年生存率為94%。這充分證明，用這一基因檢測系統，可準確判斷淋巴結陽性患者的預后，并避免對部分可長期無風險生存的患者實施過度治療。

2.3 MammaPrint對新輔助化療療效預測

病理完全緩解率與患者生存期長短關系密切。Straver等［5］2009年在荷蘭進行了一項旨在評價MammaPrint預測的低危及高危組與新輔助化療病理完全緩解率相關性的研究。這一研究共納入167例患者，接受MammaPrint檢測后分為低危組23例(14%)，高危組144例(86%)。Her-2陰性患者化療方案為：多柔比星+環磷酰胺或多西他賽及多西他賽+卡培他濱；Her-2陽性患者化療方案為：紫杉醇+曲妥珠單抗+卡鉑。結果顯示低危組無病理完全緩解，高危組的病理完全緩解率為20%，總的病理完全緩解率為17%。對于化療的敏感性，低危組為9%，高危組為37%(P=0.008)。這一研究提示，通過MammaPrint篩選出來的高危組有較高的化療敏感性及病理完全緩解率，可積極實施新輔助化療。

2.4 MammaPrint對輔助化療療效預測

雖然蒽環類、紫杉類化療藥的聯合方案在乳腺癌術后輔助化療中的療效已被證實，但仍有約20%～30%的患者不能從中獲益。Knauer等［6］進行的臨床研究共納入1 637例淋巴結陰性的乳腺癌患者，其中90%激素受體陽性。按照MammaPrint檢測結果，將患者分為低危組及高危組，分析兩組患者對輔助化療的獲益程度。共有226例患者接受了輔助化療，絕大多數是基于蒽環類的聯合化療方案。研究的終點是乳腺癌BCSS和DDFS。中位隨 訪7.6年，低危組和高危組隨訪5年的BCSS及DDFS分別為97% vs 87%，95% vs 82%，低危組BCSS及DDFS明顯優于高危組。這一研究結果顯示，MammaPrint預測的低危組輔助化療不能獲益，而高危組輔助化療獲益顯著。Albain等［7］進行的研究也得出相似的結果，提示MammaPrint對于淋巴結陰性、激素受體陽性患者輔助化療療效預測有相當高的準確性。

2.5 MammaPrint對不同雌、孕激素水平者的預后預測

雌、孕激素受體水平是乳腺癌患者的獨立預后因素。雌、孕激素受體陽性者預后遠優于陰性者。Bueno-de-Mesquita等［8］對701例乳腺癌患者激素受體水平分層后發現，淋巴結陰性激素受體陽性患者低危組、高危組的比例分別為55%(76/139)和45%(63/139)，這與臨床觀察到的雌、孕激素受體陽性者內分泌治療40%～60%的有效率相吻合，提示MammaPrint對于激素受體陽性患者預后預測的價值是肯定的。同一組患者中，激素受體陰性患者低危組只有6%(10/156)，高危組的比例卻高達94%(146/156)，這一研究提示Mammaprint對于激素受體陰性患者預后預測有相當大的局限性。

2.6 MammaPrint對絕經后患者的預后預測

MammaPrint最初設計是用于預測淋巴結陰性年輕患者的預后。然而多數乳腺癌是絕經后患者，身體狀況總體比絕經前患者差，如何準確判斷這部分患者的預后從而對化療進行取舍更有實際意義。Wittner等［9］對100例中位年齡62.5歲絕經后淋巴結陰性患者進行MammaPrint檢測，中位隨訪11.3年。MammaPrint低、高危組預測值分別為27%(27/100)和73%(73/100)。所有患者均接受了乳房切除術或保乳術及必要的腋窩淋巴結清掃術，根據病情，術后行放療、化療或內分泌治療。隨訪10年，預測低危組的27例患者無一例出現復發轉移；而高危組73例患者中只有9例發生復發轉移。這一系統對于低危組10年遠處轉移的陰性預測值(真陰性值/預測陰性值)×100%，10年遠處轉移的陽性預測值(真陽性值/預測陽性值)為12%。這項針對絕經后患者的研究說明，MammaPrint系統能較準確地區分不需要化療可長期生存的患者，從而避免過度治療。

3 有關MammaPrint的前瞻性研究

3.1 RASTER實驗

RASTER實驗是Bueno-de-Mesquita等［10］于2004年—2007年進行的前瞻性臨床研究，共納入16家荷蘭醫院的585例患者，其中158例由于樣品不符合要求而排除，最后入選427例并成功提取新鮮冰凍組織的RNA進行MammaPrint檢測，低、高危組預測值分別為51%(219/427)和49%(208/427)，與 Mook等［4］的研究結果相仿。所有患者至少隨訪5年。研究者同時也進行了對比分析：Adjuvant! Online系統69%的患者被評為高危組；St Gallen系統高危組的比例達到83%；而MammaPrint預測的高危組只有49%。這一前瞻性的臨床研究說明，MammaPrint檢測系統可提供更精確的預后信息。這項實驗證實了臨床多中心大規模進行MammaPrint檢測的可行性，為接下來的MINDACT實驗奠定了堅實的基礎。

3.2 MINDACT實驗

由于RASTER實驗旨在論證MammaPrint臨床應用的可行性及對患者術后輔助化療決策的影響，卻不能評價MammaPrint預測低危組不使用輔助化療對于患者生存的影響。于是Mook等[11]設計了MINDACT試驗。這是一項多中心前瞻性隨機對照臨床實驗，始于2007年，計劃3年內入組6 000例淋巴結陰性的乳腺癌患者。所有患者均行MammaPrint與臨床病理指標(本研究采用Adjuvant! Online)雙重評價。如兩者均評價患者預后良好(預計13%)，則不行化療；如兩者均評價患者預后不良(預計55%)，則行化療；對于兩者預后評價不一致的患者(預計32%)，將被隨機分為兩組：臨床病理指標評價預后組，MammaPrint評價預后組，并按照各自的預后預測結果決定是否行輔助化療。這一研究的核心分組是臨床病理指標評價高危組而MammaPrint評價低危組被隨機分配到MammaPrint組，對這一組患者長期隨訪的結果將最終明確MammaPrint與臨床病指標的相關性。關于MINDACT臨床試驗眾說紛紜［12-13］，針對這種基于高通量基因檢測技術的臨床實驗所引起的道德、法律等問題現在尚沒有定論。但這一研究對于MammaPrint檢測系統由基礎研究、臨床驗證到臨床應用是最具說服力的，相信最終結果將對乳腺癌的治療產生積極影響。

4 MammaPrint成效分析

Retèl等［14］從3個MammaPrint的回顧性研究中305例淋巴結陰性激素受體陽性乳腺癌患者，用構建的馬爾科夫數學模型分析MammaPrint、St Gallen及Adjuvant！Online 3種預測模型用于指導患者治療的成效比：成本項目包括患者檢查、治療及護理等總費用；以10年生存、質量調整生存及生活質量作為效益指標。結果發現3者在總生存方面沒有明顯差異，但在質量調整生存方面差異顯著：用MammaPrint作預后預測并指導治療組，質量調整生存率最高，同時成效比也是最優化。Tong等［15］針對MammaPrint和Adjuvant！Online的成效比研究得出類似的結論：MammaPrint使35%的患者重新分組，9%的患者避免化療。與Adjuvant！Online相比，MammaPrint增加了0.13的壽命年和0.16的質量調整壽命年。

5 其他一些主要基因預后預測系統及與MammaPrint 的比較

5.1 乳腺癌分子分型

Perou等［16］利用cDNA微陣列技術分析65個手術切除乳腺癌標本，從8 102個基因中篩選出456個差異較大的基因，定義為“固有基因型”。研究者進一步分析這456個差異基因，將乳腺癌分為4個不同的亞型：Luminal型［雌激素和(或)孕激素受體陽性］；Her-2陽性型(激素受體陰性)；基底細胞型(Her-2及激素受體均陰性)及正常乳腺型。Luminal型又進一步分為Luminal A和Luminal B型［17］。Yu等［18］的研究首次證實了這5種分子分型同樣適用于亞洲乳腺癌患者。Rouzier等［19］認為乳腺癌的分子分型不僅預示患者的預后不同，且對治療的反應也不同，基底細胞型及Her-2陽性型預后最差，但這兩組亞型對化療的敏感性卻最高。

5.2 21-gene(Oncotype DX)

Paik等［20］用RT-PCR方法檢測福爾馬林固定石蠟包埋組織的DNA，從250個候選基因中選出與患者預后最相關的21個基因，以此計算患者10年復發風險評分(RS)。低危組RS＜18，中危組18≥RS＜30，高危組RS≥30。多個臨床驗證證實了Oncotype DX對乳腺癌患者的預后預測優于臨床病理指標［21］。

5.3 其他

除了分子分型、MammaPrint及Oncotype DX外，用于檢測新鮮或冰凍組織mRNA的由60個雌激素陽性基因及16個雌激素陰性基因組成的76基因檢測系統［22］，檢測4%的甲醛溶液固定石蠟包埋組織的2基因檢測系統(HOXB13：IL17BR)［23］，結合基因等級指數預測預后(GGI)的97基因［24］、188基因系統［25］及92基因系統［26］等都顯示對患者預后預測有一定的價值。

眾多的基因檢測系統，到底哪種預測模型更好？Fan等［27］對295個樣本進行檢測，對比研究分子分型、MammaPrint、Oncotype DX及2基因(H:I)系統對于相同病例預后預測的一致性。研究者發現，除了2基因系統對預后預測無統計學意義外，對于同一個體大多數預測系統對患者預后預測結果相類似。基底細胞型、Her-2陽性型、激素受體陰性及Luminal B型的MammaPrint評價預后不良，Oncotype DX評價同樣為高復發風險。進一步的研究發現，MammaPrint與Oncotype DX只有一個重疊基因SCUBE2，兩者的檢測方法、算法不同，但對大多數患者的預后預測結果是較一致的，全部試驗組中，兩者預測一致性的比例為81% 。研究者推測不同的基因檢測系統預測預后相似度較高的原因，與不同個體、不同分組之間共同的生物學特點有關，有必要進行深入地研究，以提供更優化的預測模型。

6 MammaPrint與個體化治療

目前臨床常用NCCN(national comprehensive cancer network)指南或St.Gallen評估患者是否需要接受輔助化療，但這兩種系統都是基于傳統的臨床病理指標(患者年齡、腫瘤大小及分級、激素受體水平、腋窩淋巴結等)進行評估。Ebctcg［28］的研究指出，60%～70%的腋窩淋巴結陰性乳腺癌患者，單用局部治療也能獲得較好的10年總生存，只有30%～40%的患者會出現遠處轉移。使用臨床病理指標進行評估使得這些患者中的大部分接受了不必要的輔助化療。MammaPrint是基于基因水平的多基因檢測系統，上述涉及的多個回顧性的臨床驗證已初步證實了其對患者預后預測明顯優于臨床病理指標，可較為準確地區分高危及低?；颊?，據此可給予相應的個體化治療，最大限度避免過度治療及治療不足。

7 結語

MammaPrint是基于cDNA的高通量多基因檢測技術，需要從新鮮冰凍組織提取RNA，而RNA又容易在體外降解。故其對標本的質量、轉運、儲存等有極高的要求，4%甲醛溶液固定石蠟包埋的標本無法行MammaPrint檢測，這是其無法大規模進行臨床驗證、應用的最主要原因。較高的檢測費用(約4 000美元/例)，也限制了其在大多數國家開展研究與臨床應用。另外，多項回顧性的臨床驗證均顯示MammaPrint對患者預后預測的優越性，并且前瞻性的臨床研究(RASTER)已證實了臨床實施的可行性，正在進行的大規模前瞻性的臨床研究MINDACT實驗會最終明確MammaPrint對于患者預后預測的準確性及相對于臨床病理指標的優越性。相信隨著預測模型的不斷優化，更準確、簡便、費用更適合的預測模型將對乳腺癌的個體化治療發揮更大的指導作用。

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