上皮間質轉化與乳腺癌的研究進展

屈洪波 綜述 吳誠義 審校

重慶醫科大學附屬第一醫院內分泌外科，重慶 400016

上皮間質轉化(epithelial-mesenchymal transition，EMT) 是指上皮細胞通過特定程序轉化為具有間質表型細胞的生物學過程。EMT使上皮細胞失去了細胞極性及與基底膜連接等上皮表型特征，而獲得高遷移、侵襲、抗凋亡及降解細胞外基質等間質表型特征。EMT的腫瘤干細胞特征對常規化療更具抵抗性，因此，深入探討惡性腫瘤發生EMT的分子機制，將為靶向EMT關鍵分子的治療研究提供新的理論依據。

1 EMT相關標志物與乳腺癌

乳腺癌細胞系全基因組轉錄譜的鑒定結果顯示，EMT相關標志物的表達與其侵襲轉移顯著相關［1-2］。研究表明，基底型乳腺癌更易發生EMT，具有更高的侵襲轉移能力［3］。從骨髓微轉移灶分離的乳腺癌細胞也顯示與侵襲轉移相關的EMT特征［4］。研究還發現，在原發性乳腺癌中常出現細胞角蛋白缺失，這與EMT在促使癌細胞擴散至周圍基質的機制相一致［4］。

EMT的一個重要特征是同種表型細胞黏附分子的缺失。E-鈣黏蛋白是維持上皮表型的重要黏附分子，其功能缺失在誘導乳腺良性病變進展為惡性病變過程中發揮關鍵作用。E-鈣黏蛋白部分缺失或完全缺失與腫瘤低分化、高侵襲力及臨床預后差密切相關［5］。E-鈣黏蛋白維持正常組織結構和上皮細胞行為是基于不同的調控機制，而這些機制在乳腺癌中表現為失功能，盡管E-鈣黏蛋白CDH1基因位點缺失和伴隨的雜合性缺失在維持乳腺小葉癌基因沉默中發揮重要作用［5］，但是EMT的發生主要與轉錄水平上E-鈣黏蛋白下調有關，這可能是由CDH1啟動子超甲基化或轉錄抑制所致［6］。事實上，乳腺導管癌中存在不同程度E-鈣黏蛋白缺失，表明在乳腺癌侵襲早期，組織微環境即有E-鈣黏蛋白轉錄水平的短暫下調［5］。

研究還表明，E-鈣黏蛋白的表達下調能夠明顯增強乳腺癌侵襲轉移能力［7］，而給予外源性E-鈣黏蛋白盡管并不足以使間質細胞表型逆轉，但能夠抑制乳腺癌轉移［8-9］。

E-鈣黏蛋白在EMT中具有細胞黏附及信號轉導的雙重作用。首先，E-鈣黏蛋白缺失將造成細胞間黏附下降，致使細胞連接松散；其次，E-鈣黏蛋白缺失可促使β-連環蛋白遷移至細胞膜，進而激活Wnt信號通路和EMT相關的下游信號通路，進一步誘導自身轉錄抑制因子產生，如TWIST，ZEB1互反饋環路。

除E-鈣黏蛋白表達缺失外，細胞間黏附連接的完整性也受到連環蛋白下調的影響，連環蛋白通過分子橋連接到E-鈣黏蛋白及肌動蛋白骨架上；研究發現緊密連接、橋粒及上皮細胞極性相關基因在EMT過程中同時被下調，導致細胞間連接松散和極性消失［10-11］。E-鈣黏蛋白在EMT中下調，通常與“鈣黏連蛋白轉換”相關，最終誘導產生非上皮性鈣黏蛋白產生，如N-鈣黏蛋白。間質細胞高表達N-鈣黏蛋白與乳腺癌侵襲轉移及臨床預后較差相關［12］。

波形蛋白(Vimentin)被認為是間質細胞的另一種重要標志物，在維持間質特征中發揮作用。研究證實，體外培養的上皮細胞早期通常表達Vimentin以適應培養環境，Vimentin的高表達與多個乳腺癌細胞系的侵襲、轉移及EMT相關，被認為與其他間質標志物共同發揮調節作用，如細胞外基質Tenascin C。盡管基于E-鈣黏蛋白下調的機制已基本明確，但EMT過程中如何誘導Vimentin表達的分子機制仍不清楚。研究證實，乳腺癌細胞β-連環蛋白/淋巴細胞增強因子-1途徑介導Vimentin表達，這與β-連環蛋白激活后E-鈣黏蛋白缺失相一致［13］。最近研究證實，Vimentin的表達是EMT晚期事件，表明基因調控的暫時性和上皮細胞表型缺失先于間質表型獲得［14］。ZEB2/SIP1在EMT中，以一種獨立于β-連環蛋白的形式間接促進Vimentin表達［14］，表明在誘導EMT相關Vimentin的表達中存在不為人知的轉錄激活因子。

另一個間質標志物FSP1/S100A4被認為是誘導EMT發生的早期事件，其表達水平與乳腺癌惡性進展相關。在乳腺癌小鼠模型中，證實FSP1/S100A4作為EMT標志物在啟動乳腺癌轉移中發揮重要作用［15］。

2 EMT相關轉錄因子與乳腺癌

以往研究證實，多個相互關聯的信號轉導通路和胞外信號分子協同參與乳腺癌EMT調節［1］。EMT通過誘導乳腺癌外在細胞因子，如腫瘤壞死因子-α (TNF-α)，轉化生長因子-β (TGF-β)、血小板源性生長因子(PDGF)、肝細胞生長因子(HGF)及堿性成纖維生長因子(bFGF)，結合相應受體，從而激活胞內效應子，如Ras、NF-κB、Smads、β-連環蛋白及整合素等。同時，EMT也能被細胞外基質成分誘導，通過分泌基質金屬蛋白酶(MMPs)來完成細胞外基質重塑［1］。

另外，通過誘導螺旋-環-螺旋轉錄因子，如TWIST、SNAIL1/2、ZEB1、ZEB1/SIP1、GOOSECOID及FOXC2等的激活，最終下調上皮性標志物表達，促進間質表型獲得。大量的研究證實，乳腺癌中多個EMT轉錄因子的上調與臨床預后較差直接相關［1,16-19］，如SNAIL過表達與乳腺浸潤性導管癌低分化、淋巴結轉移相關［16］，TWIST高表達與侵襲性小葉癌相關，GOOSECOID高表達與乳腺導管癌相關［17］。

在人表皮生長因子受體-2 (Her-2)誘導的乳腺癌小鼠模型中，證實腫瘤復發與EMT中SNAIL上調有關［18］，SLUG高表達與乳腺癌臨床預后差相關［19］。ZEB1上調與乳腺侵襲性導管癌及未分化小葉癌上皮去分化相關，同時發現ZEB1在腫瘤相關間質細胞中也存在高表達。但是有關腫瘤相關間質細胞是否來源于EMT過程中ZEB1誘導的腫瘤細胞，有待進一步實驗驗證。

3 EMT與乳腺癌微環境的相互應答

在乳腺癌進展中，胚胎性轉錄因子再表達可能是由于遺傳的不穩定性或局部組織微環境的交互作用。支持前者的研究發現小鼠乳腺Singleminded-2s的缺失，其通過SLUG誘導EMT發生，揭示了在成體乳腺中基因失活能夠促使EMT發生［20］。而支持后者的研究，發現低氧環境下，SNAIL及SLUG異常表達及向胞核聚集，闡明低氧微環境在介導EMT發生的作用機制［21-22］。

盡管在腫瘤進展早期，組織微環境對于腫瘤發展是不利的，但隨著腫瘤進展，其可有效阻斷來源于宿主的細胞毒信號產生，促使炎性反應，通過募集腫瘤浸潤的淋巴細胞以適應宿主反應，而這些腫瘤細胞、周圍基質與炎性細胞之間的相互應答，通過分泌MMPs、ECM、生長因子及細胞因子從而誘導局部組織重塑，導致EMT發生及侵襲轉移。在乳腺癌細胞與巨噬細胞共培養實驗中，證實NF-κB介導的SNAIL途徑能夠誘導EMT發生，并增強了乳腺癌遷移及侵襲能力［23］。

以上的觀點同樣也適于間質上皮轉化(mesenchymal-epithelial transition，MET)。一開始腫瘤細胞通過誘導EMT發生從而適應炎性微環境，而當處于非炎性微環境的遠處轉移灶時，可誘導EMT部分逆轉及MET。通常侵襲性乳腺癌原發灶顯示間質特征，而遠處轉移灶顯示上皮特征。

盡管位于上皮細胞附近的成纖維細胞的修飾作用在許多腫瘤模型中被證實，然而有關成纖維細胞來源的問題仍存在爭議。EMT的一種潛在機制是腫瘤細胞調控源于上皮細胞的間質。Petersen等［24］認為乳腺癌能夠通過EMT產生針對自身的非惡性間質，反過來促進原發腫瘤的生長。

4 EMT賦予乳腺癌干細胞特征

最近，Mani等［25］證實具有遷移侵襲能力的乳腺癌細胞EMT化后獲得了干細胞樣潛能。CD44+/CD24-/low乳腺癌細胞表型被定義為富集了干細胞樣特征的乳腺癌干細胞亞群，即具有自我更新能力及多向分化能力［26］。因此，永生化的人乳腺上皮細胞在不同的EMT誘導因子作用下可獲得自我更新能力及CD44+/CD24-/low表型。反之，從乳腺癌組織中分離的癌干細胞高表達間質標志物。Morel等［27］發現Ras/MAPK通路的異常激活不但能誘導CD44+/CD24-/low亞群和EMT混合表型產生，而且低氧誘導SLUG的活化與基底樣乳腺癌表型獲得及干細胞相關基因表達明顯相關，如CD133及BMI-1。Hennessy等［28］通過體內實驗發現， CD8T細胞誘導EMT發生，獲得的間質腫瘤細胞具有干細胞特征，再次表明異常炎性反應可促進乳腺癌進展，同時基因組轉錄譜顯示化生性、低黏附性乳腺癌細胞也具有EMT及干細胞樣特征。綜上所述，不同乳腺癌細胞系可通過EMT獲得干細胞樣特征，EMT不僅有利于腫瘤細胞脫離原發灶，也促進繼發性腫瘤產生。

目前有關癌干細胞特征與EMT之間的分子機制仍未完全清楚。Dimeo等［29］在乳腺癌小鼠肺轉移模型中，通過LRP6抑制Wnt信號通路能減少癌干細胞產生及逆轉EMT，從而恢復上皮細胞表型、抑制SLUG及TWIST表達。隨著多個與Wnt信號通路相關組分在調控乳腺癌肺轉移的機制被證實，表明靶向Wnt信號通路對于控制EMT相關的乳腺癌復發及轉移具有重要意義。

5 EMT、癌干細胞樣特征與化療抵抗性

EMT及干細胞潛能獲得對乳腺癌研究具有重要意義。乳腺癌細胞在經歷EMT后具有更強生存能力及耐藥性。體外實驗發現TWIST能夠通過依賴于P53和Rb信號通路對抗癌基因誘導的細胞凋亡［30］及細胞衰老［31］，多柔比星能夠誘導乳腺癌MCF-7細胞系TWIST表達，介導EMT發生、多藥耐藥及腫瘤侵襲性。進一步體內異種移植瘤實驗證實，小干擾RNA介導的TWIST沉默能明顯下調多柔比星化療抵抗性及降低P53活性［32］。

SNAIL通過在轉錄水平上抑制多個促凋亡基因從而產生抗凋亡作用。因此，除了誘導EMT發生及增強細胞侵襲外，SNAIL家族成員具有對抗多柔比星誘導的細胞凋亡作用。反之，通過RNA干擾沉默SNAIL基因可逆轉多柔比星耐藥性［33］，而SNAil及TWIST介導的EMT在TrkB誘導的細胞凋亡抑制途徑中發揮重要作用［34］。因此，EMT能夠使乳腺癌細胞在脫離基底膜環境下繼續生存，最終促進腫瘤轉移及擴散。

在哺乳動物的研究發現，YB-1基因可能在調控EMT相關的轉錄因子網絡中發揮重要作用。例如，SNAIL、ZEB/SIP1等蛋白具有誘導間質表型獲得和介導腫瘤侵襲轉移的能力。YB-1不僅參與EMT調控，還抑制增殖相關基因表達，因而具有抗增殖活性?？傊琘B-1基因的激活使癌細胞獲得轉移能力的同時進入休眠狀態。過表達YB-1的細胞顯示干細胞樣特征，如低增殖，表達干細胞標志物P63、CD44、CD10的上調和CD24的下調［35］，表明YB-1可能并不受細胞分裂期藥物的影響，而靶向YB-1很可能刺激轉移細胞增殖。因此，作為EMT下游調控因子的YB-1將是一種有效的治療靶點。

癌灶中大部分處于增殖期細胞能被化療藥物消滅，然而仍有小部分表達CD44+/CD24-/low癌干細胞亞群似乎對化療有內在抵抗性，并具有促使腫瘤復發及乳腺球形成的能力［36］。最近，通過檢測內分泌治療及化療后殘存乳腺癌細胞亞群基因表達譜，結果顯示殘存的乳腺癌細胞具有EMT特征、癌干細胞潛能及化療抵抗性，同時相應基因表達譜也發現殘留細胞具有腫瘤起始細胞及間質特征［37］。

總之，EMT與癌干細胞間的轉化最終使癌細胞獲得了化療抵抗性及抗凋亡能力，細胞進入休眠狀態以逃避細胞毒性藥物的殺傷作用。有人提出假設，化療可促使腫瘤以一個更具侵襲的模式參與復發轉移，同時表明抑制或逆轉EMT能夠改善乳腺癌化療效果。

6 結語

綜上所述，EMT不僅賦予乳腺癌細胞侵襲、轉移特征，而且賦予化療抵抗性及癌干細胞樣特征。EMT、化療抵抗性及癌干細胞之間的交互作用促使人們設想開發針對EMT的靶向藥物。通過藥物抑制EMT發生或MET促使癌干細胞向一種高分化上皮表型分化，從而誘導細胞發生凋亡及提高對常規化療敏感性。因此，靶向EMT可能是一種有效的治療途徑，抑制EMT不僅能抑制腫瘤侵襲轉移，而且能抑制癌干細胞生成。目前在多種腫瘤中發現參與調節EMT的多個信號通路也參與對癌干細胞自我更新的調節，故靶向EMT和癌干細胞共同信號通路將是一種新的治療策略。

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