豬鏈球菌2型毒力相關因子及保護性抗原研究進展＊

何永聚，祝令偉，馮書章

豬鏈球菌是在世界范圍內傳播的一個重要的人獸共患病原體，可引起豬的腦脊膜炎、肺炎、心內膜炎、敗血病、關節炎等癥狀。在已分離的豬鏈球菌35個血清型中，豬鏈球菌2型（SS2）流行范圍最廣。1998年和2005年在中國江蘇省與四川省暴發了人感染SS2的疫情，分別引起14人和38人死亡［1］。目前已有報道超過700人感染SS2的病例，且主要集中在東南亞［2］。因此SS2嚴重危害著公共衛生安全，已引起了科研人員及公眾的廣泛關注。

目前已經發現了許多SS2典型的毒力因子，其中莢膜多糖是最早被發現的主要的毒力因子［3］，之后其它一些毒力因子如溶血素、胞外蛋白因子、溶菌酶釋放蛋白、黏附素等也相繼被發現。然而研究發現，一些強毒菌株缺失掉這些毒力因子后，SS2仍有毒力，在一些無毒或弱毒菌株中也能檢測到這些毒力因子的存在，因此認為SS2可能還存在著結構與功能未知的毒力因子。以下對近幾年新發現的毒力相關因子和保護性抗原進行論述。

1 調節因子

調節因子是在細菌基因表達調控中，在各種刺激信號的影響下通過信號傳導能直接或間接地識別或結合在各順式作用元件的序列上，參與調控靶基因轉錄效率的因子，分正調控和負調控。這些因子雖不直接表達毒力蛋白，但大多能調節細菌在體內的生存、對環境的耐受以及毒力因子的表達，是細菌重要的毒力相關因子，也是疫苗研究和新型抗菌藥物研究的重要靶點。

1．1 調節因子luxS luxS因子被報道在調節細菌各種活動和種間傳播方面發揮顯著作用。在Wang Y等［4］的研究中，他們構建了SS2基因缺失菌株△luxS，與野生株相比，突變株溶血活力明顯降低，對HEp－2細胞的黏附也降低了51%。通過實時定量PCR顯示，已知的毒力因子如gdh、cps、mrp、gapdh、sly、fbps和ef 等在體內的表達分別降低0．66、0．61、0．45、0．48、0．29、0．57 和0．38。在感染斑馬魚動物模型的實驗中，△luxS的半數致死劑量顯著升高。這些實驗結果表明，luxS的缺失，使細菌的溶血活力、對細胞的粘附力及一些重要毒力因子的轉錄水平發生了變化。luxS因子因能干擾細菌的信號傳輸，對細菌毒力因子的表達有重要作用。

1．2 二元信號調節系統CiaRH 二元信號調節系統（Two－component regulatory systems，TCS）是致病菌中普遍存在的一種跨膜信號轉導機制，在調節毒力基因的表達中有重要作用。Li J等［5］構建了TCSCiaRH基因敲除突變株，并研究突變株與野生株比較在體內與體外毒力變化情況，突變株對Hep－2和PIEC上皮細胞的粘附力顯著減弱，CiaRH缺失使巨噬細胞對SS2的吞噬力增加，也提高了SS2在體內血液中的清除率，CD1小鼠與豬的體內感染實驗也表明細菌致病力減弱。這些結果表明，CiaRH對豬鏈球菌2型的毒力也是必需的。

1．3 正向調節因子AdcR和Fur 鋅和鐵是細菌中一些蛋白的重要組分，在鏈球菌中AdcR和Fur控制著鋅和鐵的運輸。在Aranda J等［6］的研究中，利用鼠模型測定SS2△AdcR和△Fur缺失株的毒力變化。結果顯示，△AdcR和△Fur缺失株與野生型親本株比較，毒力顯著減弱，并且所有缺失菌株對氧化應激反應更加敏感。他們的數據證明AdcR和Fur基因在SS2氧化應激反應與SS2的全毒力中發揮著重要作用。

1．4 觸發因子（Trigger factor） Wu T 等［7］在研究中，闡明了觸發因子與細菌耐受應激與毒力的關系，并構建了SS2的SC21菌株tig全基因缺失菌株（△tig）和恢復互補菌株（C△tig），實驗證明，缺失菌株對HEp－2細胞的粘附力顯著減弱、溶血能力下降，并對熱、氧化、酸等應激耐受力下降，通過實時定量PCR顯示tig基因對已知的SS2的主要毒力因子，如cps、sly、mrp 等有顯著影響，同時△tig 的LD50也顯著降低。這些都指明觸發因子在SS2感染的發病機制和應激耐受方面發揮重要作用。

1．5 轉錄調控因子Rgg 王忠勝等［8］構建了SS2強毒株05ZYH33調控因子Rgg的突變株，用基因芯片的方法分析野生株與缺失株的基因表達差異，并在突變株中發現了45個基因表達變化較大的基因，其中19個表達上調，26個表達下調。這些基因在細菌毒力、免疫抗原、DNA合成和修復、基礎代謝和ABC轉運系統等方面起著重要作用，說明Rgg是一個全局調控因子。

2 表面蛋白

細菌的表面元件，尤其是表面蛋白，由于和外界環境直接接觸，與病原菌的生存能力和致病性等密切相關。表面蛋白大多在細菌對細胞的黏附、血液的侵襲、凝血過程、免疫逃避以及營養物質跨膜遞送等多方面發揮關鍵作用，是多種病原菌感染宿主的必要環節［9］。SS2等革蘭氏陽性菌表面蛋白要錨定在細菌細胞壁上，需要分選酶的切割并在分選酶的催化下與肽聚糖共價鍵結合。表面蛋白一般是重要的毒力因子或具有良好的免疫原性的保護性蛋白。2．1 分選酶Srt（Sortase） 革蘭氏陽性細菌表面蛋白和菌毛要錨定在細胞壁上需要分選酶（sortase，Srt）的催化參與。在SS2基因組中已知有6個與 Srt同源性的蛋白 （srtA、srtB、srtC、srtD、srtE、srtF），其中srtB、srtC、srtD 是一個簇。srtA是管家分選酶，負責所有含“LPXTG”基序的表面蛋白的催化和錨定。陳紅娜等［10］利用基因重組原理構建了srtBCD缺失的突變株，體外實驗結果顯示srtBCD缺失后細菌的生長速率減慢，與Hep－2上皮細胞的粘附率明顯降低，小鼠毒力實驗數據表明突變株毒力無明顯變化。實驗證明SS2的srtBCD基因與細菌的黏附能力有重要關系。陳紅娜等［11］還構建了05ZYH33srtF同源突變體，突變菌株與野生菌株在菌落形態、生長速率及對小鼠的致病力上均無顯著差異，但在小鼠競爭實驗中發現，突變株在心臟的定殖及感染能力上顯著減弱。

2．2 菌毛亞單位（pilus subunit） 細菌的菌毛是細菌比較關鍵的毒力因子，其菌毛亞單位也看作極好的疫苗候選者，但是菌毛成分在SS2中的功能性作用和免疫保護潛力還未被研究。Garibaldi M等［12］使用蛋白組學方法，發現了一個SS2表面蛋白，經生物信息學分析、免疫印跡及免疫熒光檢測顯示是細菌的菌毛亞單位輔基，用小鼠模型做重組菌毛亞單位蛋白的免疫保護性實驗，結果表明對小鼠SS2的感染有顯著的保護作用。秦躍紅等［13］構建了SS2中國強毒株05ZYH33菌毛骨架蛋白編碼基因SSU2101敲除突變株，生物學特性和小鼠致病性試驗顯示：雖然突變株的菌落形態、溶血活性以及染色特性方面與野生株之間均無明顯差異，但突變株的毒力比野生株顯著減弱。研究結果也提示菌毛在SS2感染致病過程中起重要作用。

2．3 保護性抗原HP0197 HP0197是一種新的已被確定的具有免疫原性的蛋白，在C端具有典型分選信號“LPXTG”，與已知的蛋白沒有任何同源性。Zhang A［14］等發現HP0197是一種新的表面保護性抗原，并對其保護性進行了鑒定，在豬和小鼠模型內研究了它的保護效力，并做了體外細胞試驗和被動免疫試驗。證明HP0197具有很好的保護效力，這個蛋白也被認為很可能成為新型疫苗的候選者。

2．4 保護性抗原 HP0272 Chen B等［15］發現了一個新的具有免疫原性的表面蛋白HP0272，用純化的HP0272免疫小鼠模型，能誘發顯著的體液免疫反應，有很高的抗體滴度，對致死劑量的SS2感染具有完全的保護作用。實時定量PCR發現HP0272在幾乎所有的SS2菌株和半數其他型的參照菌株中存在，可以作為新型疫苗的候選者。

2．5 6－磷酸葡萄糖脫氫酶（6－phosphogluconate－dehyrogenase） 6－磷酸葡萄糖脫氫酶是與戊糖磷酸循環有關的酶，它催化6－磷酸葡萄糖氧化脫羧成5－磷酸核糖，同時釋放NADP，NADP認為是NADPH的主要來源。Tan C［16］等對6－磷酸葡萄糖脫氫酶基因進行克隆表達，并證明6－磷酸葡萄糖脫氫酶是一種細胞壁表面蛋白，在小鼠模型中進行試驗，證明6－磷酸葡萄糖脫氫酶具有粘附素的作用，在hep－2及hela競爭抑制性細胞試驗中，6－磷酸葡萄糖脫氫酶競爭性干擾SS2對這兩種細胞的粘附，干擾率分別為72%和66%。在動物保護性實驗中，對CD－1小鼠內的保護效率達80%，是一種較好的保護性細胞表面抗原。

2．6 類枯草桿菌絲氨酸蛋白酶SspA（subtilisinlike serine protease） Bonifait L等［17］證實 SS2中的SspA與在其它致病性鏈球菌中的功能一樣，在SS2的感染過程中發揮重要作用。Hu Q等［18］研究發現在SS2發病機制中SspA位于細菌表面，分別進行體內與體外表達發現，體內表達遠遠高于體外表達，SspA蛋白約170kDa，具有生化活性，與其他微生物產生的枯草桿菌蛋白酶相似。它具有很高的蛋白酶水解活性，同時能夠水解纖維蛋白原Aa鏈，因此可以抑制有凝血酶介導的纖維蛋白的生成。SspA在SS2感染機制中發揮著重要作用，敲除這個基因的突變株與野生菌株相比毒力明顯減弱，在感染動物體內能夠促進抗體的產生，證明SspA與SS2毒力有關。

2．7 lgA1蛋白酶 致病菌的lgA1蛋白酶有助于細菌侵入機體的黏膜免疫系統。Zhang A等［19］研究發現，當iga基因缺失時，SS2的侵襲力明顯減弱。因此推斷，在侵入宿主的黏膜免疫系統時，分泌性的lgA1蛋白酶發揮著重要作用。另外，感染實驗表明，敲除iga基因的菌株導致該致病菌的致死率下降。實驗研究也表明lgA1蛋白酶可能是豬鏈球菌的毒力因子之一，在SS2的致病機制中起一定作用。

2．8 HtpS（histidine triad protein of Streptococcus suis）蛋白 三聯組氨酸蛋白屬于一個與豬鏈球菌表面相關的蛋白家族，該家族包含來自肺炎鏈球菌和化膿性鏈球菌的PhtA、PhtB、PhtD、PhtE、HtpA 5個成員，它們也被證實可作為宿主感染的保護性抗原。Shao Z等［20］研究發現在 SS2的05ZYH33菌株中有一段與HtpA、PhtD高度同源的基因序列，并命名為HtpS。他們發現HtpS在SS2高度保守并在豬鏈球菌35個血清型中廣泛存在（29／35）。在SS2感染中表達的HtpS蛋白經免疫印跡和流式細胞儀驗證屬于細胞表面相關蛋白。抗HtpS蛋白血清能增加人體內補體3的沉積并能降低SS2在血液中的溶血效應。經重組蛋白HtpS免疫后的小鼠能顯著增加它們在SS2感染后的存活率。

3 其它毒力相關因子

3．1 Trag（transfer gene G）基因 Trag基因是利用體內誘導抗原技術 IVI－AT （in vivo－induced antigen technology）通量篩選鑒定的豬鏈球菌2型的致病相關因子，Trag參與細菌的分泌途徑，是IV型分泌系統（type IV secretion system，TFSS）的組成成分，Trag基因在細菌感染過程中可能參與毒力因子的轉移、毒力蛋白的分泌，使宿主菌產生相應的酶或毒素，導致毒力增強。祝昊丹［21］等檢測1998年江蘇及2005年四川流行株和其它臨床分離株中的Trag基因分布結果顯示，SS2、SS7中幾乎都有Trag基因的存在，SS9中大部分含有Trag，但是非毒力菌株SS1、SS1／2和蘭氏C群豬源鏈球菌中沒有Trag基因，這表明Trag基因可能與豬鏈球菌的毒力有關。

3．2 lin0523基因 李鵬等［22］利用溫敏穿梭自殺質粒pSET4s，定點敲除SS2野生型強毒株ZY458的lin0523基因，構建基因缺失突變菌株458Δlin，利用家兔感染模型對ZY458及其突變菌株的生物學特性進行比較研究。接種ZY458感染組家兔5／5死亡，458Δlin（plin）感染組家兔 4／5 死亡。而458Δlin感染組家兔生長正常，未出現任何明顯臨床癥狀，證實lin0523基因與豬鏈球菌2型的毒力密切相關。

3．3 SSGI4基因島 祝令偉等［23］通過比較豬鏈球菌2型強毒株與弱毒株和無毒株的基因組差異，發現一個只存在于強毒株，而在弱毒或無毒菌株中沒有的基因島，并命名為SSGI4。該基因島全長11 269bp，包含11個編碼基因，部分基因推測為可能的膜表面蛋白基因或氨基酸結合蛋白基因。新發現的基因島SSGI4具有致病性基因島的各項典型特征，可能與豬鏈球菌2型強毒株的致病性有關。

3．4 AI1（angiogenin inhibitor 1） 透明質酸酶（hyaluronidase，HAase）是能使透明質酸產生低分子化作用酶的總稱，它在SS2感染過程中能夠降低體內透明質酸的活性，從而提高SS2在組織中液體滲透能力［24］。Tao Wu等［25］發現了1個與SS2透明質酸酶有關的新型血管生成素抑制因子AI1，血管生成素抑制因子是1種核糖核酸酶。應用酵母雙雜交系統顯示AI1與酵母中的透明質酸酶有關系，免疫共沉淀分析也證明AI1與透明質酸酶有關系。并且在正常細胞和SS2感染的細胞中都發現了所篩選的CDNA的轉錄和翻譯，且這些過程主要集中于293T細胞的細胞質中。這些結果表明AI1可能通過干擾SS2中透明質酸酶影響SS2感染的發病機制。

3．5 異檸檬酸脫氫酶IDH（isocitrate dehydrogenase） 異檸檬酸脫氫酶是檸檬酸循環過程中的關鍵酶，這個酶可以催化檸檬酸化合物經氧化脫羧作用生成α－酮戊二酸和NAD（P）H，在細菌的生存中不可缺少。Wang P等［26］過表達并研究了了SS2強毒株05ZYH33中的IDH，IDH大小約為74kDa，并且發現在SS2中，陽性Mg2＋是對IDH影響最大的二價離子。IDH優化最合適的pH分別是 Mn2＋7．0、Mg2＋8．5，溫度分別是 Mn2＋30℃、Mg2＋50℃活力最高。在SS2中IDH對NAD＋是一個重要的輔酶，Wang P等研究認為IDH是SS2生存中重要的代謝酶，并期望IDH作為SS2感染檢測和血清學診斷的重要因子。

綜上所述，雖然已經發現了很多SS2的毒力因子，但SS2如何在動物體內傳播和感染，其主要的毒力因子是如何發揮作用的仍然所知有限。對已驗證的、具有免疫保護作用的SS2強毒株主要毒力因子莢膜多糖（cps）的爭論也很多，因為很多無毒菌株也是有莢膜的。除cps外，很多可能的主要毒力因子也不是僅存在于豬鏈球菌強毒株中的，在弱毒或無毒菌株中它們都可以被發現。一些強毒菌株的毒力因子被敲除后，在多數情況下，它們的毒力會喪失或下降，這可能是因為SS2的致病機理是多因子共同協作的結果，毒力因子之間的關系可能是互補的，1個因子的缺失導致整個菌株毒力的喪失或下降。所以對SS2的致病機理及毒力因子等方面的研究意義重大，還需廣大科研工作者進一步探索。

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