微小隱孢子蟲重組蛋白CP23與CP15/60－23免疫原性的研究＊

張 珍，劉春會，杜鎮鎮，王 冬

微小隱孢子蟲感染引起的隱孢子蟲?。–ryptosporidiosis）是一種全球性以腹瀉為主要癥狀的人獸共患寄生蟲病。篩選出免疫原性較強的基因片段，用于此病的免疫診斷、預防與治療，是防治此病的主要手段之一［1］。有學者研究表明，微小隱孢子蟲CP23基因編碼的蛋白是宿主免疫識別的主要蛋白，能夠刺激機體產生強烈的免疫反應；CP15/60、CP15等也以其較強的免疫原性，有望成為免疫診斷、免疫預防與治療的靶抗原［2］。本課題前期研究中成功構建了重組表達質粒p ET－30a－23和p ET－30a－15/60－23復合基因載體，誘導表達了大量的重組蛋白 CP23 和 CP15/60－23［3］。為進一步觀察重組蛋白CP23、CP15/60－23的免疫原性，將其配以免疫佐劑免疫小鼠，分別檢測小鼠的體液和細胞免疫功能及抗隱孢子蟲的感染能力，從而為人類隱孢子蟲多價亞單位疫苗的研用提供基礎。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 BALB/c小鼠60只，雌雄各半，SPF級，體重14～16g，購于山東大學醫學院實驗動物中心。

1.1.2 主要試劑與儀器 重組蛋白CP23和CP15/60－23由本實驗室構建、表達和純化；1640培養液（上?？寺∩锔呒夹g公司）；小牛血清（上海復旦天呈公司）；堿性磷酸酶（AP）標記的羊抗鼠IgG結合物及兔抗大鼠IgG結合物；小鼠IFN－γ、IL－12檢測試劑盒均為晶美生物工程公司產品；MK3型酶標儀（芬蘭Labsystems公司）；FC500型流式細胞儀（美國Beckman Coulter公司）。

1.2 方法

1.2.1 動物免疫 BALB/c小鼠60只，隨機分為3組，每組20只。分別為磷酸緩沖液（PBS）對照組、重組蛋白CP23免疫組、重組蛋白CP15/60－23免疫組。每只小鼠背部皮下多點注射弗氏完全佐劑和抗原混合物共100μL/只，對照組注射同量佐劑與PBS的混合物。每隔2w免疫1次，共免疫3次。每次免疫前剪尾取血，最后一次免疫2w后，75%的酒精消毒，摘眼球取血，收集血清，用于檢測抗體及細胞因子。

1.2.2 小鼠特異性IgG抗體檢測 采用間接ELISA法檢測免疫小鼠血清中特異性抗體，包被抗原為大腸埃希菌表達的重組CP23蛋白、重組CP15/60－23蛋白。用1%小牛血清（BSA）封閉，不同稀釋度各組免疫鼠血清、正常鼠血清為一抗、羊抗鼠IgG－AP結合物為二抗，對硝基苯基磷酸鈉（p NPP）底物顯色，酶標儀測吸光度（A405值）；檢測孔A405＞2.1陰性對照（正常鼠血清）孔A405者判為陽性，計算血清IgG抗體滴度，動態檢測免疫小鼠特異性抗CP23、CP15/60－23的抗體。

1.2.3 小鼠脾臟T細胞CD＋4、CD＋8亞群檢測 末次免疫后2w，隨機取各組BALB/c小鼠各5只，無菌取脾，制備脾細胞懸液，調整細胞數至5×106/m L，分別加入 FITC－CD3/PE－CD4 和 FITC－CD3/PE－CD8單抗，混勻后室溫放置30 min后用流式細胞儀檢測并計算T細胞亞群CD＋4、CD＋8的百分率和CD＋4/CD＋8比值。

1.2.4 小鼠細胞因子的檢測 將脾細胞懸液濃度調至6.4×107/m L，分別滴入96孔無菌細胞培養板中，每孔0.2 m L，培養3 d后，收集上清。取培養液上清包被96孔反應板，常規ELISA法檢測IFN－γ、IL－12。

1.2.5 卵囊攻擊感染 第3次免疫2周后，將各組剩余BALB/c小鼠計45只（每組15只），分別灌胃接種1×106個卵囊，于接種第3 d開始收集小鼠糞便并稱重，用簡化的不連續蔗糖密度梯度離心法提取、純化糞便中的卵囊，檢測卵囊排出情況，計算平均每克糞便中卵囊數。

1.2.6 統計學分析 采用SPSS 10.0軟件作統計學分析。各組間CD＋4、CD＋8百分率及細胞因子之間的比較用單因素方差分析，P＜0.05認為有統計學意義。

2 結 果

2.1 IgG抗體滴度比較 隨著免疫次數的增加，實驗組小鼠免疫血清中IgG抗體滴度都逐漸升高，尤其是重組CP15/60－23免疫后血清中IgG抗體滴度升高更為明顯，見表1。

表1 3次免疫后小鼠血清中IgG抗體平均幾何滴度Tab.1 The dynamic results of IgG in serial serum of mice

2.2 T淋巴細胞百分率比較 第3次免疫后2w，小鼠脾臟T細胞CD＋4、CD＋8百分比及CD＋4/CD＋8都增高，與對照組相比均有顯著性差異（P＜0.01），兩實驗組間差異無統計學意義，見表2。

表2 免疫后小鼠脾T細胞CD4＋、CD8＋及百分比值（±s）Tab.2 The percentages of CD4＋and CD8＋T lymphocytes in mice spleen after immunization±s）

表2 免疫后小鼠脾T細胞CD4＋、CD8＋及百分比值（±s）Tab.2 The percentages of CD4＋and CD8＋T lymphocytes in mice spleen after immunization±s）

※與對照組相比有差異，P＜0.05。

組 別CD＋4（%）CD＋8（%）CD＋4/CD＋8 PBS對照組24.18±3.30 9.92±1.14 2.44±0.16重組蛋白CP23組 44.02±2.29※ 14.98±1.05※ 2.95±0.29※重組蛋白CP15/60－23組 47.15±2.47※ 15.92±0.98※ 2.93±0.26※

2.3 細胞因子IFN－γ檢測結果 單因素方差分析結果表明，經抗原刺激后的脾細胞培養上清中IFN－γ的滴度都有不同程度的增加，明顯高于對照組，差異有統計學意義（P＜0.05）。重組蛋白CP23組IFN－γ平均幾何滴度為8.98，重組蛋白 CP15/60－23組為16，組間差異無統計學意義（P＞0.05）。

2.4 細胞因子IL－12檢測結果 單因素方差分析結果表明，經抗原刺激后的脾細胞培養上清中細胞因子IL－12的滴度都有不同程度的增加，與對照組差異有統計學意義（P＜0.05）。重組蛋白CP23組IL－12平均幾何滴度為8.00，重組蛋白 CP15/60－23組為11.31，組間差異無統計學意義（P＞0.05）。

2.5 攻擊感染后糞便卵囊比較 用微小隱孢子蟲卵囊接種免疫后的小鼠，各組小鼠糞便中的卵囊數量都很低，實驗組小鼠的潛伏期延長，卵囊排出期亦略縮短，各組之間無明顯差異（P＞0.05），見圖1。

圖1 攻擊感染后各組小鼠卵囊排出結果Fig.1 Comparison of oocysts shedding after challenge

3 討 論

目前隱孢子蟲感染的保護性免疫機制尚不清楚。有研究認為體液免疫和細胞免疫在抗隱孢子蟲感染中都起一定作用，多數學者認為以細胞免疫為主，尤其CD＋4細胞的增加發揮很大作用，IFN－γ與IL－12亦可使卵囊排出減少，對抵抗感染起一定作用［4］。本研究結果用重組 CP23及 CP15/60－23抗原免疫小鼠后，小鼠脾臟T細胞CD＋4、CD＋8及CD＋4/CD＋8也增加，說明兩種重組抗原體內都能刺激淋巴細胞增殖，尤其CD＋4T淋巴細胞的增殖更為明顯。此研究結果還顯示，隨著免疫次數的增加，實驗組小鼠免疫血清中IgG抗體滴度都逐漸升高，尤其是重組蛋白CP15/60－23組升高更為明顯，并且兩種重組抗原都可在體外刺激脾細胞產生大量的保護性細胞因子IFN－γ和IL－12。

本實驗用卵囊攻擊感染免疫后的小鼠，各組小鼠糞便中的卵囊數量都很低，各組之間無明顯差異。這可能與感染動物的年齡因素有關，黃克和等［5］亦證實成年小鼠對隱孢子蟲感染有抵抗性，而2w齡以內的小鼠則容易感染，本實驗小鼠周齡均較長，因此皆不易受感染。

總之，本研究不僅證實CP23可被T細胞識別，是潛在的B細胞的免疫原，是增殖反應和血清學研究的理想對象［6］，還證實了聯合重組抗原CP15/60－23也有很好的免疫活性，與重組CP23一樣，體內能刺激機體產生高滴度的特異性抗體，刺激CD＋4淋巴細胞增殖，體外刺激脾細胞產生保護性細胞因子，兩者都可以作為亞單位疫苗的理想侯選抗原，而且具有純度高，制備簡便等優點。有望研制出效果優異的亞單位疫苗以用于隱孢子蟲病的預防。

［1］柏雪蓮，張玉梅，周秀芝，等.微小隱孢子蟲pcDNA3.0－23重組質粒免疫效果評價［J］.中國公共衛生，2010，26（8）：1007－1009.

［2］黃炳成，李瑾，魏慶寬，等.微小隱孢子蟲重組 BCG－CP15/60－23疫苗免疫原性的研究［J］.中國病原生物學雜志，2008，3（12）：920－922.

［3］宰德富，張佃波，魏慶寬，等.微小隱孢子蟲CP23基因的克隆及表達［J］.中國病原生物學雜志，2006，1（3）：193－196.

［4］Tessema TS，Dauber E，Petry F.Adoptive transfer of protective immunity fromCryptosporidiumparvum－infected interferon gamma and interleuk in－12－deficient mice to naive recipients［J］.Vaccine，2009，27（47）：6575－6581.

［5］黃克和，楊世廣，唐建霞.從感染小鼠獲得微小隱孢子蟲卵囊方法的改進［J］.中國寄生蟲學與寄生蟲病雜志，2001，19（6）：360－362.

［6］Smith LM，Priest JW，Lammie PJ，et al.Human T and B cell immunoreactivity to a recombinant 23－k DaCryptosporidium parvumantigen［J］.J Parasitol，2001，87（3）：704－707.