南蛇藤中扁塑藤素對照品的制備及鑒定

張立 王定勇

南蛇藤中扁塑藤素對照品的制備及鑒定

張立 王定勇

目的建立從南蛇藤(Celastrus orbiculatus Thunb.)根皮中制備扁塑藤素(pristimerin)對照品的方法。方法采用溶劑提取、硅膠柱層析和重結晶等方法對南蛇藤根皮丙酮提取物進行分離純化，通過MS、IR、1H-NMR和13C-NMR進行結構鑒定，通過薄層色譜(TLC)和高效液相色譜(HPLC)對對照品進行純度檢測。結果從南蛇藤根皮中分離純化出扁塑藤素對照品，質量分數＞99.0%。結論該方法制備的扁塑藤素對照品符合中藥化學對照品的相關要求，可作為南蛇藤及其制劑質量控制用的化學對照品。

南蛇藤根皮;南蛇藤;對照品制備

南蛇藤(Celastrus orbiculatus Thunb.)系衛矛科南蛇藤屬植物，又名過山風、降龍草等。該植物生于山谷溪邊灌叢或林邊，在我國分布廣泛，除青海和新疆未見記載外，其他地區均有分布。南蛇藤全草均可入藥，有袪風濕，活血脈，消腫解毒等功效，常用于治療筋骨疼痛，四肢麻木，癰疽腫毒，小兒驚風，痧癥，痢疾等癥［1］。目前已從南蛇藤植物中分離得到60余個化合物，主要為β-二氫沉香呋喃倍半萜、生物堿、三萜類，此外還含有黃酮類、有機酸類、甾體及鞣質［2］。筆者在南蛇藤藥材的質量控制研究過程當中，由于缺少化學對照品，因而無法準確控制南蛇藤藥材及其相關制劑的質量，因此，迫切需要研制一種或多種對照品。扁塑藤素(pristimerin)是南蛇藤中的一種重要化學物質，具有廣譜抗腫瘤［3，4］、抗炎［5］、抗氧化［6］等多種藥理活性，且在南蛇藤中含量較高。本文從南蛇藤中提取、分離和純化扁塑藤素，制備扁塑藤素對照品，為制定和完善南蛇藤及其制劑的質量標準提供扁塑藤素對照品。

1 儀器及材料

X-6顯微熔點測定儀(北京泰克儀器有限公司，未校正);Nicolet PROT-G-460紅外光譜儀(KBr壓片，美國Nicolet公司);Agilent6120型質譜儀(美國Agilent公司);Bruker AM-500型核磁共振儀(TMS為內標，瑞士Bruker公司);LC-10ATvp型高效液相色譜儀(SHIMADZU公司);SPD-M10Avp紫外檢測器(SHIMADZU公司)。搖擺式高速中藥粉碎機(大德中藥機械有限公司)，RE-52CS旋轉蒸發器(河南省鞏義市英峪予華儀器廠)。

南蛇藤于2008年10月采自廣東陽春市，由廣東藥學院中藥學院李樹淵教授鑒定為南蛇藤(Celastrus orbiculatus Thunb.)，標本存放于廣東藥學院天然藥物化學實驗室。硅膠(200～300目，青島海洋化工廠)，聚酰膠(60～100目，浙江省臺州市路橋四甲生化塑料廠)，水為蒸餾水，色譜用甲醇為色譜純，其余試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 扁塑藤素的制備 取南蛇藤根皮1 kg粉碎至60目左右，置于一5L規格圓底燒瓶中，用丙酮3500 ml為提取溶劑，回流提取2次，每次提取1.5 h，抽濾，濾液合并后減壓濃縮得浸膏150 g;上述浸膏(150 g)先進行聚酰膠(60-100目，2 kg)柱(Ф150 mm ×L1500 mm)層析，以甲醇-水 =4:1(V/V)為洗脫劑，流速≤6 ml/min，收集紅色洗脫液，減壓濃縮該洗脫液得紅色粉末狀固定(45 g);該紅色粉末狀固定(45.0 g)再進行硅膠(200～300目，1 kg)柱(Ф100 mm×L1000 mm)色譜，流速≤6 ml/min，依次用洗脫劑 φ110000 ml、洗脫劑φ2 50000 ml洗脫色譜柱，收集φ2洗脫液部分收集(其中洗脫劑φ1由石油醚和乙酸乙酯按體積比20:1組成;洗脫劑φ2由石油醚和乙酸乙酯按體積比10∶1組成);將上述φ2洗脫液置于旋轉蒸發儀上減壓蒸發去除溶劑后得到扁塑藤素粗品(25.0 g);將扁塑藤素粗品用石油醚-乙酸乙酯(10:1，V/V)150 ml回流溶解，趁熱抽濾去除不溶性雜質，濾液重新回流至澄清后先置于室溫2 h，然后放置0℃冰箱中析晶，24 h后有大量橙紅色針狀晶體析出，抽濾，收集紅色針狀晶體，即得扁塑藤素純品(8.5 g)。

圖1 扁塑藤素對照品的核磁共振氫譜

圖2 扁塑藤素對照品的核磁共振碳譜

2.2 對照品的理化性質及結構鑒定橙紅色針狀晶體(石油醚-乙酸乙酯)，mp.219.0 ～220.0℃。ESI-MS(positive mode)m/z:487 ［M+Na］+，465 ［M+H］+，263，202，201;IR νmax(KBr)cm-1:3350，2940，1725，1650，1590，1520，1435，1375，1300，1245，1220，1205，1185，1155，l145，1095，1085，990，870，860，850;1H-NMR(500 MHz，CDCl3):δ 7.02(1H，d，J=7.1Hz，H-6)，6.52(1H，s，H-1)，6.34(1H，d，J=7.1Hz，H-7)，6.96(1H，brs，-OH)，3.52(3H，s，H-31)，2.23(3H，s，H-23)，1.45(3H，s，H-25)，1.25(3H，s，H-26)，1.17(3H，s，H-30)，1.08(3H，s，H-28)，0.52(3H，s，H-27);13C-NMR(125 MHz，CDCl3):δ 119.5(C-1)，178.2(C-2)，146.0(C-3)，117.2(C-4)，127.4(C-5)，134.2(C-6)，118.1(C-7)，170.3(C-8)，43.0(C-9)，164.8(C-10)，33.5(C-11)，29.6(C-12)，39.4(C-13)，45.0(C-14)，28.6(C-15)，36.4(C-16)，30.5(C-17)，44.3(C-18)，30.9(C-19)，40.4(C-20)，29.9(C-21)，34.8(C-22)，10.2(C-23)，38.2(C-25)，21.6(C-26)，18.3(C-27)，31.6(C-28)，178.7(C-29)，32.7(C-30)，51.5(C-31)。以上數據與文獻［7］報道的扁塑藤素(pristimerin)相關數據一致。見圖1～3。

圖3 扁塑藤素對照品的質譜

2.3 對照品的純度檢測

2.3.1 對照品的薄層色譜法檢查 將對照品用甲醇配制成1 mg/ml的溶液，分別點樣 5、10、20 μL，分別以石油醚-乙酸乙酯(體積比2∶1)、三氯甲烷-丙酮 (體積比3∶1)和三氯甲烷-甲醇(體積比20∶1)為展開劑，在硅膠G板上展開。分別在365 nm紫外燈、日光下觀察以及碘缸中顯色觀察。結果表明，在3種展開劑中對照品均為1個斑點，未見其他雜質斑點，Rf值分別為0.55、0.65和0.78。

圖4 扁塑藤素對照品的HPLC圖

2.3.2 對照品的HPLC法檢查 稱取扁塑藤素0.001 g，在甲醇溶液中溶解并定容到10 ml，得到質量濃度為0.1 mg/ml的樣品溶液。取上述樣品溶液1 ml用流動相定容到50 ml，得到質量濃度為2 μg/ml的對照品溶液。色譜柱為迪馬公司 DiamonsilTM C18柱(5 μm，250 mm ×4.6 mm)，以甲醇-0.1%H3PO4(體積比88∶12)為流動相，流速為1 ml/min，柱溫為35℃，檢測波長為258 nm，對照品溶液質量濃度為2 μg/ml，進樣量為20 μl。結果表明，在該色譜條件下所得HPLC圖譜中顯1個主峰，保留時間為9.82 min，質量分數以峰面積歸一化法計算為99.69%。在改變流動相分析及將釆集時間延長數倍時，均未出現異常峰。RP-HPLC色譜圖見圖4。

［1］ 江蘇新醫學院，中藥大辭典(下冊).上海:上海科學技術出版社，2000:1563-1567.

［2］ 陳源旺，丁立平，歐陽明安.南蛇藤化學成分研究進展.亞熱帶植物科學，2007，36(1):79-84.

［3］ WU C C，CHAN M L，CHEN W Y，et al.Pristimerin induces caspase-dependent apoptosis in MDA-MB-231 cells via direct effects on mitochondria.Mol.Cancer Ther， 2005， 4(8):1277-1285.

［4］ YANG H J，LANDIS-PIWOWAR K R，LIU D，et al.Pristimerin induces apoptosis by targeting the proteasome in prostate cancer cells.J Cell Biochem，2008，103:234-244.

［5］ 惠斌，吳勇杰，王鴻，等.扁蒴藤素對急性實驗性炎癥的作田及其機制研究.中國藥理學通報，2003，19(6):656-659.

［6］ 陳長瑞，李文廣，吳勇杰，等.扁蒴藤素的抗氧化與抗腫瘤作用.中藥藥理與臨床，2002，18(5):20-21.

［7］ 蔣毅，李鶴，羅思奇，等.南蛇藤活性成分的研究.中草藥，1996，27(2):73-74.

Preparation and identification of pristimerin reference substance from Celastrus orbiculatus

ZHANG Li，WANG Ding-yong.Department of Pharmacy， Guangdong Provincial Hospital of TCM， Guangzhou 510120，China

Objective To establish a method for preparation of pristimerin reference substance from the root bark of Celastrus orbiculatus Thunb.Methods Pristimerin was isolated and purified from the acetone extract of the root bark of C.orbiculatus by solvent extraction，silica gel column chromatography and re-crystallization respectively.Its structure was identified by MS，IR，1H-NMR and13C-NMR.Its purity was detected by thin layer chromatography(TLC)and high pressure liquid chromatography(HPLC).Results Pristimerin reference substance was obtained from the stem bark of C.orbiculatus，and its purity was over 99.0%.Conclusion Pristimerin reference substance prepared by this method can meet the demands of Chinese drug chemical reference substances and be used in the quality control of the C.orbiculatus materials including its preparations.

Root bark of Celastrus orbiculatus;Pristimerin;Preparation of reference substances

10.14164/j.cnki.cn11-5581/r.2012.11.010

510120廣東省中醫院藥學部(張立);廣東藥學院藥科學院(王定勇)

王定勇 E-mail:wdingyong@163.com