一株珙桐內生細菌GT21的鑒定及系統發育分析

馬莉莉，張宇美，宋培勇

（1.湄潭縣求是高級中學，貴州湄潭564106；2.廣東海洋大學生命科學學院，廣東湛江5240883；3.遵義師范學院生物系，貴州遵義563002）

植物內生菌指生活在植物體內而一般不引起植物病害的微生物的總稱，包括真菌、細菌和放線菌，是一類潛在的寶貴的微生物資源，具有增強宿主植物抗逆性、抗病蟲害和促進植物生長等作用以及用于轉基因操作等。內生菌促進植物生長的機制是通過生物固氮、產生植物激素、增強礦質營養吸收、抑制植物病原體等來實現的。Ryu等還發現了內生細菌一種新的促生長機制：產生揮發性物質如2，3-丁二醇和Aceotin來促進植物生長[1]。Downing等和Turner等報道了轉基因工程內生細菌Herbaspirillum serope dicae和Clavibacter xylii能產生并分泌原本為蘇云金芽孢桿菌產生的對多種昆蟲幼蟲有毒殺作用的δ-內毒素[2，3]。迄今雖然已有很多植物內生菌的報道，但是有關珙桐內生菌的報道較少，何映霞等報道了從珙桐中分離到一株產黃酮內生真菌Asper-gillus fumigatus[4]，宋培勇等對從珙桐中分離到的15株內生細菌進行了分子鑒定和系統發育分析[5]。對珙桐等珍稀植物進行內生菌分離鑒定并加以深入研究，不但可以了解其內生菌生物多樣性、群落結構、生物學特征及其與宿主植物相互關系等，而且從中還可能篩選出具有實際應用價值的生防菌株或產生生物活性物質的菌株，為珙桐等珍稀野生植物資源的保護和開發提供科學依據。本文以從珙桐中分離到的一株內生細菌為出發菌株，對其進行了較為系統的研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株

試驗所用菌株GT21，由遵義師范學院生物系微生物實驗室提供，從采自貴州寬闊水國家級自然保護區的珙桐葉柄中分離而得。

1.1.2 主要試劑和儀器

試驗中所用的PCR擴增引物為：27f:5′-GAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，1525r:5′-AGAAAGGAGGTGATCCAGCC-3′（生工）。2×Taq PCR MasterMix（天根），膠回收試劑盒（Omega），PCR擴增儀（BioRad），WD-9413A凝膠成像系統（北京六一）。

1.1.3 培養基

牛肉膏蛋白胨培養基、脲酶測定培養基和卵磷脂酶測定培養基以及V-P反應、甲基紅試驗，吲哚試驗和糖發酵試驗等培養基參考文獻[6]進行配制。

1.2 方法

1.2.1 內生細菌GT21轉接

利用無菌操作技術從斜面挑取少量菌苔劃線接種于牛肉膏蛋白胨培養基平板上，25℃培養直至長出單菌落。

1.2.2 內生細菌的形態學鑒定

菌落形態：觀察菌落的大小、顏色、質地、邊緣、凸起、干濕、光澤等特征。

細胞形態：參考文獻[6]介紹的方法對供試菌株進行革蘭氏染色觀察，用孔雀綠染色觀察芽孢。1.2.3生理生化鑒定

接觸酶、脲酶、卵磷脂酶測定，V-P反應，甲基紅試驗，吲哚試驗，糖發酵試驗以及耐鹽性試驗等按文獻[6]進行。

1.2.4 16S rDNA PCR擴增及測序

基因組DNA提取按文獻[7]介紹的水煮法進行。16S rDNA PCR擴增體系和條件見文獻[5]。

凝膠電泳檢測16S rDNA PCR擴增結果，用凝膠回收試劑盒切膠純化后，交北京諾賽基因組研究中心有限公司測序。

1.2.5 同源性比對及系統發育樹的構建

登錄NCBI用BLAST軟件將測序結果與Gen－Bank中的已知序列進行比對，查找相似性最高的菌種，取相似性最高的5株同源菌株和1株蘇云金芽孢桿菌與GT21的16S rDNA序列，用MEGA4.0軟件進行多序列比對，構建出系統發育樹。

2 結果與討論

2.1 形態鑒定

菌株GT21在牛肉膏蛋白胨培養基上形成的菌落較薄，橢圓形或近圓形，乳白色，表面光滑，邊緣整齊，不透明。革蘭氏染色呈陽性，細胞呈桿狀。芽胞為橢圓形或柱狀，端生或次端生。

2.2 生理生化鑒定

對菌株GT21進行了13項生理生化測試，結果列于表1。

表1 菌株GT21生理生化反應結果

2.3 耐鹽性試驗

耐鹽性試驗表明，待測菌株能在質量分數為11%，13%的培養基中生長，不能在質量分數為7%和9%的培養基中生長。

根據形態學和生理生化特征，并與文獻[8]記錄的芽孢桿菌屬（Bacillus）的所有種進行一一比較，發現該菌株與該菌屬的所有種不一致。

2.416 S rDNA的PCR擴增與測序

GT21菌株16S rDNA PCR擴增產物大小為1500bp左右，實際測序結果為1293個核苷酸（Nt）（見圖1），其中左圖為16S rDNA PCR擴增結果：M為200bp DNA Ladder，21指珙桐內生菌株GT21；右圖為16S rDNA測序結果。

輸入測序結果（查詢號NS9GUZHR013），利用BLAST進行搜索比對，查找相似性最高的同源菌株，發現與其相似性最高的同源菌株為Bacillus sp.SAP02_1（注冊號：JN872500），相似性97%。取相似性最高的前5株同源菌株：Bacillus sp.SAP02_1（注冊號JN872500），Bacillus sp.MB1（2011）（注冊號HQ600985）、Bacillus sp.LM6（注冊號JN208185）、Bacillus sp.BM3（2011）（注冊號JF825991）、Bacillus sp.PKSWII（注冊號F768713）以及蘇云金芽孢桿菌（Bacillus thuringiensis）（注冊號FN433029）和GT21共7株細菌的16S rDNA序列，利用Mega4.0軟件構建出系統發育樹（見圖2），GT21單獨一支，其余6株細菌聚為一支，GT21與Bacillus sp.PKSWII和Bacillus sp.LM6親緣關系較近，而與Bacillus sp.SAP021、Bacillus sp.BM1（2011）等親緣關系較遠。

圖1 GT2116S rDNA的PCR擴增與測序結果

圖2 GT21及其同源菌株基于16S rDNA序列的系統發育樹

3 結論與展望

對從珙桐中分離得到的內生細菌GT21進行形態學、生理生化特征等系統研究，并結合分子鑒定結果，根據文獻[8]將其初步鑒定為芽孢桿菌（Bacillus），與文獻中記錄的種不一致，是否為一新種，有待進一步鑒定。根據16S rDNA測序結果用BLAST軟件進行相似性搜索比對，發現其相似性最高的菌株為Bacillus sp.SAP02_1，相似性為97%。通過構建系統進化樹發現GT21與Bacillus sp.PKSWII和Bacillus sp.LM6親緣關系更近，而與Bacillus sp.SAP02_1等親緣關系較遠。

芽孢桿菌的分布和應用較廣，如在農業上，蘇云金芽孢桿菌是生防菌的典型代表。在釀造工業上，羅俊成從濃香型白酒糟醅中分離并鑒定了地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）、解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、環狀芽孢桿菌（Bacillus circulans）以及蠟狀芽孢桿菌（Bacillus cereus）[9]。在醫藥工業上，地衣芽孢桿菌是人用微生物制劑“整腸生”的主要成分。在飼料工業上，芽孢桿菌也是飼用微生物制劑“益生素”、“EM”等的主要成分之一[10]。在教學和科研上，枯草芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌等是常用的菌株。

植物內生菌的分離可能因取樣、表面消毒及培養基的不同，其數量和種類往往存在較大差異，僅僅依靠傳統的分離培養方法，想無偏好的分離到植物體內大多數的內生菌（更不用說所有的內生菌）是不現實的。令人興奮的是關于植物內生菌的研究方法目前已取得重大進展，中科院昆明植物研究所曾英研究組利用宏基因組學方法研究了滑桃樹（Trewia（nudiflora）內生菌，在世界上首次建立了植物內生菌宏基因組文庫[11]。隨著宏基因組學的發展和相關技術的成熟和完善，宏基因組學用于植物內生菌研究將更加廣泛。

[1] Ryu CM，FaragM A，Hu CH，etal.Bacterial volatiles promote growth in Arabidopsis[J].PNAS，2003，100（8）:4927-4932.

[2] Downing K J，Leslie G，Thomson J A.Biocontrol of the sugarcane borer Eldana saccharina by expression of the Bacillus thuringiensis cry1Ac7 and Serratia marcescens chiA genes in sugarcane-associated bacteria[J].Appl Environ Microbiol，2000，66（7）:2804-2810.

[3] Turner J T，Lampel J S，Stearman R S，et al.Stability of the δ-endotoxin gene from Bacillus thuringiensis subsp.kurstakiin a recombinant strain of Clavibacterxyli subsp.Cynodontis[J].Appl Environ Microbiol，1991，57（12）:3522-3528.

[4] 何映霞，冉雪琴，王嘉福.珙桐產黃酮內生真菌的分離和鑒定[J].貴州農業科學，2008，36（3）:3-6.

[5] 宋培勇，李鳳華，馬莉莉.珙桐內生細菌的分離鑒定及系統發育分析[J].微生物學通報，2011，38（1）:8-13.

[6] 周德慶.微生物學實驗手冊[M].上海:上海科學技術出版社，1983.

[7] 陶天申，楊瑞馥，東秀珠.原核生物系統學[M].北京:化學工業出版社，2007.

[8] R E布坎南，N E吉本斯.伯杰細菌鑒定手冊（第8版）[M].北京：科學出版社，1984.29-758.

[9] 羅俊成.濃香型白酒糟醅中芽孢桿菌屬細菌的分類鑒定和16S rDNA序列系統發育分析[D].成都：四川大學，2007.

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