98株河南省結核分枝桿菌氧氟沙星耐藥株gyrA基因突變的研究＊

趙玉玲，馬曉光，李 輝

隨著耐藥結核病的不斷增加，作為二線藥物的的第三代喹諾酮類在結核病治療中廣為使用，氧氟沙星耐藥菌的檢出也呈上升趨勢。早期檢測并發現喹諾酮類藥物作用靶點為DNA回旋酶，編碼該酶A亞單位的基因gyrA發生突變與氟喹諾酮類耐藥關系密切［1］。這些耐藥菌耐藥程度、耐藥基因的突變情況及其與耐藥程度間的相互關系等需要進一步的研究。為了解結核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis，MTB）耐氧氟沙星相關gyrA基因的突變情況及其耐藥機制，通過PCR和DNA測序技術測定98株gyrA基因喹諾酮耐藥決定區（Quinoloneresistance determining regions，QRDR）測序，發現了目前河南省結核分枝桿菌gyrA基因突變的新特點。

1 材料與方法

1．1 材料

1．1．1 菌株來源 結核分枝桿菌 H37Rv（菌株號：ATCC27294）和H37Ra（菌株號：ATCC35835）由中國基本預防控制中心結核病預防控制中心參比實驗室提供。126株結核分枝桿菌臨床分離株均分離自河南省結核病控制機構，為2007－2010年結核病患者（男78例，女48例，年齡19～81歲）的標本培養物，并經噻吩－2－羧酸肼（TCH）對硝荃苯甲酸（PNB）菌種鑒定為結核分枝桿菌。

1．2 方法

1．2．1 藥物敏感性試驗 應用比例法藥物敏感性試驗，參照［2］。鏈霉素（SM）、異煙肼（INH）、利福平（RFP）、乙胺丁醇（EMB）、卷曲霉素（CPM）、阿米卡星（AMK）、卡那霉素（KM）和氧氟沙星（OFLX）所采用的濃度分別為：4、0．2、40、2、40、30、30、3μg／mL。氧氟沙星 MIC測定用羅氏培養基，所用 濃 度 為 0．125，0．25，1，2，4，8，10，16，20，32μg／mL。

1．2．2 PCR擴增 采用煮沸離心取上清法提取結核菌基因組DNA，－20℃凍存備用。gyrA QRDR部位227bp進行 PCR 擴 增，所 用 引 物 為：gyrA1：5′－GACCGCAGCCACGCCAAG－3′， gyrA2： 5′－AGCATCACCATCGCCAACG－3′，PCR所用擴增酶為 Ampli Taq Gold，由生工生物公司合成。PCR擴增條件：預變性94℃4min，然后（94℃1min，60℃1min，72℃1min）共40個循環后，72℃延伸7min。

1．2．3 DNA測序 測序所用引物與PCR擴增所用引物相同。由生工生物公司完成測序，所用測序儀為ABI PRISM 310基因分析儀（Perkin Elmer Applied Biosystems）

2 結 果

GyrA基因QRDR突變情況 DNA測序結果表明，126株臨床分離株gyrA基因95位密碼子均與H37Rv AGC不同，呈現出來ACC的自然多態性。氧氟沙星耐藥的98株中，有19株沒有突變檢出，其余81株（82．6%）檢測到gyrA基因。其中68株（84%，68／81）帶有94位密碼子的突變，共發現4種類型，GAC→GGC，GCC，TAC，AAC，見表1。導致94Asp→Gly，Ala，Tyr，Asn，其中36株（44．4%，36／81）攜 有 Asp94Gly 突 變，其 余Asp94Asn，Asp94Tyr和Asp94Ala的發生率各自為31．0%（25／81），4．9%（4／81）和3．7%（3／81）。除了94位密碼子檢出突變以外，74位，90位和91位也發現有突變發生，如表1所示，58株（71．6%）氧氟沙星耐藥株攜有Ala90Val突變，16株（19．8%）帶有 Ser91Pro突變，12株（14．8%）帶有Ala74Ser突變?？傊醴承悄退幹曛術yrA QRDR部位突變發生于74，94，90和91位密碼子，而在88，89，92和93位沒有突變檢出。81株gyrA基因突變株中，有30株為單個位點突變，51株為雙位點突變，占63%（51／81）。在28株氧氟沙星敏感株（MIC小于2μg／mL）中，有3株（其 MIC為1 μg／mL）也有單個位點突變檢出，分別為Ala90Val，Asp94Gly和Ser91Pro。

表1 81株氧氟沙星耐藥菌株gyrA基因突變特征Tab．1 Mutation character in gryA of 81strains with ofloxacin－resistant

51株（63%）被檢出帶有雙位點突變。雙位點突變之中，Asp94Gly的發生率較高。有7株（14%）的雙位點突變株攜有Ala74Ser突變。沒有三位點或多位點突變發生。攜有雙位點突變的菌株中，氧氟沙星MIC值相對較高。在MIC 8～16μg／mL的菌株中，有63%（32／51）攜有雙位點突變，MIC 2～4 μg／mL的菌株中，37．3%（19／51）攜有雙位點突變。MIC小于2μg／mL的敏感株中，未見雙位點突變發生。

3 討 論

Takiff［3］、George［4］、Kocagoz［5］、Onodera［6］、Ruiru S［7］及 Pitaksajjakul P［8］、Kim H［9］等曾先后研究gyrA基因第90位、94位密碼子的突變是導致結核分枝桿菌對喹諾酮類藥物耐藥的主要因素。本文通過傳統藥敏試驗篩選98株耐氧氟沙星結核分枝桿菌臨床分離株，發現氧氟沙星耐藥株gyrA突變總突變率為84%（81／96），且突變主要集中在94，90和91位密碼子而且94位有4種類型的突變（Asp→Gly，Ala，Tyr和Asn），這與以往的報道相一致［3，10－11］。 既往 曾 有 報 道 88 位 密 碼 子 的 突 變［11］在我們的研究中未發現。本研究發現兩個新的突變特點：一是63%的耐氧氟沙星株（51／81）攜有雙位點突變；二是在所有的雙位點突變株中，14%（7／51）雙位點突變株中攜有Ala74Ser突變，該種突變類型在既往結核分枝桿菌耐藥相關基因研究中鮮見報道，通常認為它僅存在于其它類型的細菌中，在結核分枝桿菌中發生突變非常罕見［3，10－11］。這可能與菌株的來源不同、不同國家或地區對喹諾酮類藥物的選擇使用原則有所差異以及所入選的樣本量大小等因素有關。另外，除了gyrA基因突變外，是否存在其他的耐藥機制如：膜通透性降低［13］、藥物主動外排出現［14］及gyrB基因突變［3］等導致結核分枝桿菌對喹諾酮類藥物耐藥，及gyrA基因突變與耐藥水平的相互關系等需進行進一步的研究。

我國氟喹諾酮類雖尚為二線抗結核藥，但由于廣大地區在臨床治療其他疾病時廣泛應用，因此耐藥形勢不容低估。以往報道顯示菲律賓的一項全國調查表明［15］，結核分枝桿菌臨床分離株對環丙沙星的耐藥率為27%，氧氟沙星的耐藥率為35%，兩藥的共同耐藥率為17%；但美國和加拿大結核分枝桿菌氟喹諾酮類耐藥罕見［16］。為確保耐多藥結核病人有針對性的治療，了解河南省結核分枝桿菌的耐藥機制勢在必行。本研究工作發現河南地區結核分枝桿菌臨床分離株gyrA基因雙位點突變率高，表明氟喹諾酮類耐藥形勢不容樂觀。應特別引起注意，采取針對性措施，特別是對耐一線藥的耐藥結核病及耐多藥結核病的治療中，在選擇二線藥時應充分注意結核分枝桿菌氟喹諾酮類耐藥現象，有條件的省級結核病實驗室可以常規開展結核分枝桿菌氟喹諾酮類耐藥檢測，以便指導臨床治療。

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