鮑曼不動桿菌blaNDM－1基因序列分析及表達

陳 碩，邱少富，夏力亮，王中強，劉 軍，柳 楠，祝令偉，孫 洋，宋宏彬，馮書章

NDM－1最先報道于2010年8月11日，英國醫學界宣稱南亞出現了一種新型細菌，幾乎對所有抗生素都有抗藥性，被稱為“超級細菌”。確切地說，NDM－1不是一種細菌，而是一種新發現的基因blaNDM－1編 碼 的 金 屬－β－內 酰 胺 酶 （metallo－β－lactamase，MBL）。因為首次病例是在印度新德里醫院住過院的瑞士人體內發現，所以一些西方醫學者把它叫做“新德里金屬－β－內酰胺酶1（New Delhi metallo－β－lactamase－1，NDM－1）”。近來研究發現，攜帶編碼blaNDM－1基因的耐藥質粒不僅可以在細菌間轉移，而且能使所在宿主菌成為可以耐受幾乎全部抗生素的超級細菌［1］。攜帶此酶的菌株對青霉素類、頭孢菌素類、頭霉素類等β－內酰胺類和碳青霉烯類抗生素均耐藥，僅對多黏菌素及米諾環素衍生物—替加環素敏感［2］。由于該基因多定位于質粒，容易通過接合性轉導在不同細菌間傳遞，一旦病原菌獲得該基因，也會產生多重耐藥表型，其感染將變得更加難以治療。據報道，新德里的這位病人就同時感染了攜帶blaNDM－1基因質粒的肺炎克雷伯氏菌和大腸桿菌［3］。目前，這種可移動元件攜帶的高水平廣譜抗性的發展趨勢引起國內外廣泛關注。

本研究菌株NDM－1鮑曼不動桿菌分離自廈門某醫院一肺癌病人，從其痰培養分離出多重耐藥鮑曼不動桿菌，并檢出NDM－1。本實驗對該菌株的耐藥譜進行測定，并對其blaNDM－1基因進行克隆、表達及序列分析，研究其耐藥性的分子機制，為耐藥基因的水平轉移等研究奠定基礎。

1 材料與方法

1．1 材料 NDM－1鮑曼不動桿菌、E．coli DH5α為本實驗室保存；DL2000DNA Marker、質粒pMD18－T購自大連寶生物公司。凝膠回收試劑盒購自杭州維特潔生物公司；Vitek32微生物鑒定系統為法國梅里埃公司產品；美洛培南為浙江海正制藥廠生產。

1．2 NDM－1鮑曼不動桿菌菌株鑒定與藥敏實驗 使用Vitek32微生物鑒定系統，以革蘭陰性菌鑒定卡GNI＋進行菌株鑒定，藥敏卡GNS－506進行耐藥譜測定。

1．3 NDM－1鮑曼不動桿菌blaNDM－1基因的 PCR擴增與克隆 根據 GenBank的blaNDM－1基因（pKpANDM－1，登錄號FN396876．1）編碼序列設計兩條引物 LE－F：5′－GGCGTTAGATTGGCTTACACCATTAGAG－3′和 LE－R：5′－CAGGCAACAGCCGAACGAGC－3′，引物由上海生物工程技術服務有限公司合成。以NDM－1鮑曼不動桿菌基因組DNA為模板，按照以下條件擴增blaNDM－1基因：95℃預變性5min；95℃變性30s，56℃退火30s，72℃延伸1min，30個循環；72℃延伸7min。PCR產物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。凝膠回收試劑盒純化PCR產物，將其與pMD18－T載體于4℃過夜連接，再將連接產物轉化至大腸桿菌E．coli DH5α，涂布于含氨芐青霉素（100μg／mL）的LB平板篩選。挑取單菌落培養后提取質粒進行EcoRI和HindIII雙酶切鑒定，鑒定正確的重組質粒pMD18－T：：blaNDM－1送上海生物工程技術服務有限公司測序。

1．4 美洛培南對NDM－1鮑曼不動桿菌、重組E．coli DH5α（pMD18－T：：blaNDM－1）及大腸桿菌 E．coli DH5α最小抑菌濃度（Minimum inhibitory concentration，MIC）的測定 將菌液過夜培養物稀釋1 000倍，每孔100μL。美洛培南濃度從1孔至14孔分別為 128、64、32、16、8、4、2、1、0．5、0．25、0．125、0．062 5、0．031 25、0．015 625μg／mL，15孔不加藥作為生長對照。密封，35℃溫箱培養16～20h。判斷標準以孔內完全抑制細菌生長的最低藥物濃度為MIC。

2 結 果

2．1 NDM－1鮑曼不動桿菌菌株鑒定與藥敏結果Vitek32微生物自動鑒定儀鑒定此菌株為鮑曼不動桿菌。藥敏結果見表1。

表1 NDM－1鮑曼不動桿菌廈門株藥敏結果Tab．1 The antimicrobial susceptibility profile of NDM－1 Acinetobacter baumannii

2．2 NDM－1鮑曼不動桿菌blaNDM－1基因的PCR擴增、克隆與序列分析 PCR擴增產物的瓊脂糖凝膠電泳見圖1所示，結果擴增出了與預期大小一致的片段。blaNDM－1基因克隆到pMD18－T載體后進行雙酶切鑒定。酶切產物電泳檢測結果如圖2所示，說明blaNDM－1基因已克隆到載體中。

圖1 PCR擴增 NDM－1（廈門株）blaNDM－1基因Fig．1 Amplification of blaNDM－1M：DL2000DNA Marker；1：PCR products

測序結果與香港分離的大腸桿菌HK－01質粒pNDM－HK及印度肺炎克雷伯氏菌 KP－05－506質粒pKpANDM－1攜帶的blaNDM－1基因進行Blast序列比對。結果顯示，NDM－1鮑曼不動桿菌與HK－01的blaNDM－1基因序列同源性為100%；與 KP－05－506相比，在blaNDM－1和trpF之間有24bp的插入，這一段插入的序列除了存在于香港HK－01株外，還存在于 NDM－1大腸桿菌 DVR22（西班牙株）、NDM－1大腸桿菌271（澳大利亞株）、NDM－1銅綠假單胞菌（塞爾維亞株）、NDM－1鮑曼不動桿菌161／07（德國株）和 NDM－1大腸桿菌 Dok01（日本株），該段序列均位于blaNDM－1基因下游，功能未知。序列比對結果如下。

圖2 EcoRⅠ和HindⅢ雙酶切鑒定重組質粒pMD18－T：：blaNDM－1Fig．2 Identification of plasmid pMD18－T：：blaNDM－1by restriction enzyme digestionM：DL2000DNA Marker；2：plasmid fragments digested by EcoRI and HindⅢ

2．3 最小抑菌濃度的測定 美洛培南對NDM－1鮑曼不動桿菌、E．coli DH5α（pMD18－T：：blaNDM－1）及大腸桿菌E．coli DH5α最小抑菌濃度的測定結果為NDM－1鮑曼不動桿菌廈門株：128μg／mL；E．coli DH5α（pMD18－T：：blaNDM－1）：32μg／mL；E．coli DH5α：0．03125μg／mL。

3 討 論

金屬－β－內酰胺酶基因可通過染色體和轉移基因在不同細菌間傳遞，造成廣泛耐藥，多種重要的獲得性 MBLs（IMP，VIM，SPM，GIM，SIM）都是由質粒介導和可轉移基因編碼［4］。獲得性 MBLs不僅分布于腸桿菌科細菌、銅綠假單胞菌和不動桿菌中，還可通過質粒或整合子在不同菌株、種屬間傳播［5］，因此產獲得性MBLs的革蘭陰性桿菌被公認為極其重要的多重耐藥病原體［6］，給感染性疾病的臨床治療帶來嚴峻的挑戰。

藥敏實驗結果顯示，本研究NDM－1鮑曼不動桿菌對青霉素類、頭孢菌素類、頭霉素類等β－內酰胺類和碳青霉烯類抗生素均耐藥，對氨基糖苷類抗生素及喹諾酮類抗生素敏感。β－內酰胺類是處理嚴重傳染病中主要的抗生素，與碳氫霉烯類抗生素協同應用效果更好，由于碳氫霉烯類在傳染病治療上大量使用，是導致超廣譜β－內酰胺酶在腸桿菌科細菌產生和擴散的主要原因［6］。

本實驗將NDM－1鮑曼不動桿菌編碼碳青霉烯酶的blaNDM－1結構基因及其上下游調控序列克隆轉化至大腸桿菌E．coli DH5α。序列分析結果表明，該菌株blaNDM－1基 因 與 NDM－1 大 腸 桿 菌 香 港 株blaNDM－1基因序列同源性為100%，其結構基因與NDM－1克雷伯氏菌印度分離株同源性也是100%，但在blaNDM－1結構基因的下游和trpF之間有24bp的插入片段。這段24bp的插入片段至少在耐藥基因溯源上具有重要價值，還極有可能具有特殊的生物學意義，值得深入研究。

野生菌株及重組菌株對美洛培南（碳青霉烯類抗生素）最小抑菌濃度測定結果顯示，獲得了blaNDM－1基因的E．coli DH5α重組菌株對美洛培南的MIC升高了256倍，證明了blaNDM－1基因是碳青霉烯類抗生素耐藥性產生的分子基礎。E．coli DH5α（pMD18－T：：blaNDM－1）對美洛培南的 MIC值仍然比NDM－1鮑曼不動桿菌低4倍，可能的原因是該株NDM－1鮑曼不動桿菌還存在其他耐藥機制，能夠協同抵抗此類抗生素的作用。

鮑曼不動桿菌（Acinetobacter baumannii，Ab）是不動桿菌屬中最常見的一種革蘭陰性球桿菌，屬于條件致病菌，常常引起醫院相關感染［7］。從醫院環境分離的鮑曼不動桿菌，往往對多種抗生素耐藥，常被稱為“革蘭氏陰性耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（Gram－negative MRSA）”［8］。 因 此，這 些 獲 得 了NDM－1質粒的鮑曼不動桿菌，可使醫院發生相關感染的危害程度增加，治療更加困難。由于blaNDM－1基因在多種腸桿菌科細菌中被發現［9］，說明此基因可以在不同細菌間轉移，這樣就可能使得更多的細菌攜帶此基因。因此，攜帶blaNDM－1基因的細菌有可能給人類造成重大的健康威脅。

［1］孫明偉，鄭焙文，高福，等．人類與病原菌的軍備競賽：NDM－1耐藥基因與 超 級 細 菌 ［J］．生 物 工 程 學 報，2010，26（11）：1461－1472．

［2］Rose WE，Rybakh MJ．Tigecyeline：first of new class of antimicrobial agents［J］．Phannacotherapy，2006，26（8）：1099－1110．

［3］Yong D，Toleman MA，Giske CG，et al．Characterization of new metallo－beta－lactamase gene，bla（NDM－1），and a novel erythromycin esterase gene carried on a unique genetc structure in Klebsiella pneumonia sequence type 14from India［J］．Antimicrob Agents Chemother，2009，53（12）：5046－5054．

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［5］Murphy TA，Simm AM，Toleman MA，et al．Bioch emical Characterization of the Acquired Metallo－beta－Lactamase SPM－1 from Pseudomonas aeruginosa［J］．Ant imicrobial Agents and Chemotherapy，2003，47（2）：582－587．

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［7］Sobel JD．Pathogenesis and treatment of recurrent vulvovaginal candidiasis［J］．Clin Infect Dis，1992，14（Suppl1）：S148－153．

［8］Nalbanski B，Tsekova K，Ivanov S．Candidiasis and birth canal in Juries［J］．Akush Ginekol（Sofiia），2002，41：23－25．

［9］Centers for Disease Control and Prevention（CDC）．Detection of Enterobacteriaceae isolates carrying metallo－beta－lactamase－United Statea［R］．MMWR Wkly Rep，2010，59（24）：750．