2010年南京人群甲型H3N2流感分離毒株全基因組特性分析＊

羅鵬飛，曹 尚，李 偉，李 亮，吳 斌，秦圓方，鄧 斐，崔侖標，焦永軍，祁 賢，衛平民

因為抗原漂移，甲型H3N2變異株每隔2～8年形成一次新的流行，東亞和東南亞地區位于全球季節性H3N2流感病毒傳播網絡的中心位置［1］，該地區的流感毒株基因變異對于全球流感流行株的發展具有預警作用。

江蘇省2004－2008年間的優勢流行株依次為H3N2亞型、乙型 Victoria系、H3N2亞型、乙型Yamagata系［2］。自2009年4月爆發以來，豬源性甲型H1N1成為人群中優勢流感流行株，在此期間甲型H3N2流感病毒的流行情況和基因特征極少被關注。為探討豬源性甲型流感大流行后季節性H3N2病毒的基因特征，尤其是病毒表面蛋白（血凝素和神經氨酸酶）基因的變異情況，特對在南京市2010年早期監測的3株季節性H3N2流感病毒的全縣同組測序，分析毒株基因片段的遺傳特性，現將結果報告如下。

1 材料與方法

1．1 材料 2010年9月，從江蘇省流感監測網絡上報的3例南京地區H3N2流感病例的咽拭子中分離到流感病毒，并經過血凝抑制實驗和流感病毒核酸監測證實，分別命名為：A／Nanjing／1654／2010（H3N2）、A／Nanjing／1655／2010（H3N2）和 A／Nanjing／1663／2010（H3N2），依次簡稱為 Nanjing／1654、Nanjing／1655和Nanjing／1663。

1．2 方法

1．2．1 病毒RNA提取 采用德國QIAGEN公司RNeasy Mini Kit試劑盒，按試劑盒說明書中要求，處理病毒液（接種于 MDCK細胞并經5～7d培養），提取病毒RNA。

1．2．2 病毒基因片段的PCR擴增 采用INVITROGEN公司的SuperScriptⅡReverse Transcriptase試劑盒將病毒的RNA反轉錄為cDNA，然后采用TAKARA公司的TAKARA LA Taq PCR試劑盒擴增病毒8個基因組片段；擴增引物及方法詳見Hoffman等建立的流感病毒全基因組擴增方法［3］。對擴增產物進行凝膠電泳鑒定、回收目的條帶并進行凝膠DNA純化回收，獲得目的條帶的PCR純化產物。

1．2．3 序列測定與數據分析 將包含目的片段的PCR純化產物送至南京金斯瑞生物技術公司進行測序；采用DNAStar軟件中的EditSeq和MegAlign進行核苷酸序列拼接和氨基酸殘基推導、比對，采用BLASTn工具搜索NCBI中同目的片段核苷酸序列相似度最高的核苷酸序列，采用MEGA4軟件構建系統發生樹；其他甲型H3N2流感分離株的核苷酸、氨基酸序列下載于NCBI數據庫（http：／／www．ncbi．nlm．nih．gov／）。

2 結 果

2．1各個基因核苷酸序列的相似序列 所測3株病毒RNA片段1→8（PB2、PB1、PA、HA、NP、NA、M和NS）的核苷酸序列已上傳至NCBI數據庫。同季節性H3N2病毒參考毒株比對，各片段序列長度與參考株對應片段相同，不存在核苷酸插入和缺失。24個目的片段相似度最高的2010年前流感病毒株均為人甲型 H3N2流感病毒，見表1。其中Nanjing／1654的PA 片段與另一分離毒株A／California／VRDL3390／2009（H3N2）的 相 似 度 最 高（99．6%）。

2．2 進化特征 分別構建38株H3亞型流感病毒片段4和30株N2亞型流感病毒片段6核苷酸序列的進化樹（圖1）。整體來看，季節性H3N2病毒與豬群病毒間的進化關系更近，而與禽或馬源流感片段區分顯著。兩個進化樹顯示所測病毒的HA和NA片段都位于季節性H3N2毒株組成的分支，其中Nanjing／1655和Nanjing／1663處在相同的終末 分 支 上，與 日 本 毒 株 A／Niigata／1147／2010（H3N2）相近。

構建17株季節性H3N2病毒和4株豬源H3N2病毒的PB2、PB1、PA、NP、NS和 M 6個片段核苷酸序列的進化樹（圖2），因部分毒株的片段不完整而未引入進化樹中。叢書結構上看PB2、PB1、PA、NP、NS和M片段呈現出類似HA基因的進化特征，相比豬群毒株，所測病毒與相近年代疫苗株進化距離較近，同 A／Niigata／1147／2010（H3N2）最近。

圖1 基于片段4和6核苷酸序列的不同宿主來源毒株的進化樹Fig．1 Phylogenetic trees based on nucleotide sequences of segment 4and 6of isolates from different kinds of host．The phylogenetic trees are generated by neighbor－joining algorithm based on 1 000replicates，H3N2isolates（Nanjing 2010）and vaccine strain（2010－2011）are marked by black bold

圖2 基于片段1，2，3，5，7和8核苷酸序列的H3N2互型毒株的進化樹Fig．2 Phylogenetic trees based on nucleotide sequences of segment（1，2，3，5，7，8）of H3N2subtype viruses

2．3 氨基酸序列的位點分析 對比A／Perth／16／2009的HA蛋白氨基酸序列，3株流感病毒共12個氨基酸位點發生變異（Table 2）。其剪切位點序列為PEKQTR↓G，含一個堿性氨基酸（R），為低致病性流感病毒特征。HA1蛋白抗原位點變異位于A、C、D和E區［4］，氨基酸變異數目分別為3、7和7個，所測病毒株兩兩間的抗原位點變異數分別為4個（Nanjing／1654和 Nanjing／1655），4個（Nanjing／1654和 Nanjing／1663）和 2 個 （Nanjing／1655 和Nanjing／1663）。變異未發生在宿主受體結合位點（98、153、190、194、183、155、134～138和224～228位）［5］。Nanjing／1654和 A／Perth／16／2009含有10個糖基化位點（第8、22、38、63、122、126、133、165、246、285位），Nanjing／1655 和 Nanjing／1663 的第124位氨基酸為N，使的第122位的糖基化位點消失。Nanjing／1655的305R不能與281C形成二硫鍵，使得其二硫鍵數目減少一對。

對比 A／Perth／16／2009，3株病毒的 NA 蛋白共發生10個氨基酸位點變異（Table 3）。其中發生于N2亞型7個抗原決定簇［6］的變異是第342和402位，變異數目分別為1、2和1個。未見NA蛋白的酶活性中心（118R、151D、152R、224R、276E、292R、371R、406Y、119E、156R、178W、179S、198D／N、222I、227E、274H、277E、294N、425E）的耐藥位點變異292（R→K）、119（E→G／A／D／V）、294（N→S）、151（D→E）、276（E→D）［7］。3株 H3N2和 A／Perth／16／2009均包含7個糖基化位點（第61、69、70、86、146、200、234和329位）。

表2 HA蛋白的氨基酸變異位點Tab．2 Amino acid site variations distribution of HA protein

表3 HA蛋白的氨基酸變異位點Tab．3 All the amino acid site variations of NA protein

在PB2、PB1、PA 3個基因的宿主特異性保守氨基酸位點 PB2（199、475、567、627、702aa）、PB1（375aa）和 PA（55、100、382、552aa）［8］中，所測病毒PB1蛋白375位氨基酸為G，不同于A／Brisbane／10／2007、A／Nanjing／1／2009以及人群 H3N2中的S。另外，PA第510aa的突變（H→A）可能抑制病毒多聚酶復合體對RNA的核酸內切作用而降低病毒的轉錄活性，所測病毒PA第510aa均為組氨酸（H）。NP蛋白第16、33、100、136、283、313位氨基酸與宿主特異性有關，相比A／Brisbane／10／2007和A／Nanjing／1／2009，所測3株病毒此6個位點均未發生變異。

M1蛋白101～105位氨基酸（RKLKR）是M1蛋白的RNA結合區和核定位信號區，148～162位為一個潛在的CCHH鋅指結構基序（CATCEQIADSQHRSH），所測病毒的以上位點上均未變異。M2蛋白為流感病毒的離子通道蛋白，其第37和41aa為離子通道的活性核心部位，金剛烷胺類藥物與活性核心部位結合后抑制離子通道功能，所測病毒的第31位氨基酸發生耐藥性突變（S→N）而引起金剛烷胺耐藥。

NS1蛋白N端（核心序列19～38）為RNA結合域，C端（核心序列134～161）為效應區，兩個區域相 對 保 守［8］。 相 比 A／Brisbane／10／2007，Nanjing／1654的第157（V→A）位氨基酸發生變異，Nanjing／1655和Nanjing／1663未發生變異，它們的PL基序完整，均為RSKV。

PB1－F2蛋白由PB1片段的另外一個ORF編碼，完整的PB1－F2蛋白為90個氨基酸。第69～82位氨基酸被認為是線粒體靶向序列，與病毒促進宿主細 胞 凋 亡 相 關［9］。與 A／Brisbane／10／2007、A／Nanjing／1／2009以及 A／Beijing／1／1968相比，所測病毒的MTS內氨基酸未變異，但Nanjing／1655和Nanjing／1663的PB1－F2氨基酸鏈理論上在第26位發生了斷裂，可能使得蛋白截短為25aa而失去相關的功能。

3 討 論

江蘇省CDC在2010年9月之前1年多時間里未監測到南京市H3N2亞型病毒感染的病例，所分離3株病毒的基因特征可在一定程度上解釋南京地區H3N2亞型病毒的變異情況。一般認為具有代表性的甲型流感病毒新變種要存在一定的抗原性差異，并在HA1區存在4個以上的氨基酸變異，這些氨基酸的變化還必須涉及2～3個抗原決定簇［10］。參考2010－2011年H3N2疫苗株，并結合HA1基因氨基酸變異的數目和位置，我們推測，與2009年H1N1流感大流行前的H3N2流感毒株相比，新變種很可能已經形成，且毒株Nanjing／1654與另兩株病毒間可能存在抗原漂移，但這還須結合病毒抗原性檢測結果予以證明。另外，流感病毒血凝素蛋白糖基化的主要作用是穩定血凝素蛋白結構，防止血凝素蛋白被水解以及阻礙抗體對病毒的識別和清除，所測病毒糖基化位點的增加或減少對流感病毒的抗原性及其他生物學特性均有一定影響。大規模測序顯示一定范圍內的H3N2流感病毒基因特征可表現出一定的差異［11］，呈現不同“亞群”混合流行，根據本研究中3株病毒HA片段的特征推測這種分化特征可能形成，這必然會增加疫苗應用的難度。另外，8個片段的進化特征表明分離株Nanjing／1655和 Nanjing／1655與日本流感毒株 A／Niigata／1147／2010在遺傳進化上具有很高同源性，推測這類H3N2病毒可能已經形成了跨地區間的傳播。

當前的抗流感病毒藥物主要包括M2離子通道阻斷劑（金剛烷胺和金剛乙胺）和神經氨酸酶抑制劑（扎那米韋和奧司他韋）。金剛烷胺和金剛乙胺通過阻斷M2離子通道蛋白阻止病毒脫殼，使病毒RNA不能釋放到細胞質中，病毒的早期復制被中斷，從而起到抗流感病毒的作用；扎那米韋和奧司他韋特異性抑制A、B型流感病毒的NA。1994～1995年的H3N2流感毒株對 M2阻斷劑耐藥率約0．4%，但2003年后約61%的亞洲季節性H3N2流感毒株耐藥，且耐藥率還在上升［12］。本研究中H3N2病毒普遍對M2阻斷劑耐藥，而對神經氨酸酶抑制劑敏感，因此對當前H3N2流感的抗病毒治療應使用神經氨酸酶抑制劑藥物代替金剛烷胺和金剛乙胺，但嚴格管理其使用范圍和劑量，以防止NA耐藥毒株的快速產生。

面對宿主的免疫選擇作用，病毒部分基因突變會被保存下來，成為病毒進化過程中的重要標志，發生在PB1（375位）和 PB1－F2（26位）的變異可能是病毒進化過程的重要分子標志。尤其PB1－F2蛋白于2001年被發現，完整的PB1－F2在病毒感染宿主的過程中具有誘導宿主細胞凋亡等重要功能。不同宿主、不同亞型病毒的PB1－F2呈現不同的斷裂特征，H1N1亞型病毒的PB1－F2蛋白斷裂較普遍，如季節性H1N1病毒在其第57位后發生斷裂，古典豬H1N1病毒在其第11、25和34位后發生斷裂，2009年新甲型H1N1流感病毒代表株A／California／07／2009（H1N1）在其第11、57和87aa后發生斷裂，而大多數季節性H3N2病毒的PB1－F2是完整的，只有少部分地區曾報道人群H3N2病毒株PB1－F2蛋白的斷裂［9］，本次研究也首次發現了中國大陸地區的PB1－F2蛋白斷裂。

從進化關系上講，相比禽源流感病毒，豬群H3N2病毒同人群病毒具有相近的基因相似度。根據2005－2008年間的國內的豬群H3N2病毒和本次分離毒株間的遺傳關系，此次本地區重新出現的甲型H3N2病毒很可能在人群中隱性感染而不斷進化后發?。涣硪环矫妫撕颓菁仔虷3N2病毒可以分別與其結合而直接傳染給豬，又因為NCBI數據庫中暫時沒有收集到中國地區2008年以后的豬流感H3N2病毒的序列信息，同時期的豬源病毒遺傳信息未知，也不排除在豬群中進化后傳播給人。華東地區傳統的畜禽養殖模式為季節性流感病毒的進化提供了復雜的宿主結構，這也使得H3N2病毒的監測和防治工作變得更加復雜。江蘇省2005年發現的“三源重配”豬H3N2流感病毒等［13］讓我們更加準確地掌握了流感病毒在豬群中的進化特征，加強流感病毒在動物宿主中的監測，從生態學角度綜合防治成為了本地區流感防控的新方向。

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